牛和山羊胚胎生殖細胞的分離與培養(yǎng).pdf

1、該研究以牛和山羊胎兒為材料,從原始生殖細胞分離培養(yǎng)出EG細胞,并進行傳代培養(yǎng)和鑒定,對影響胚胎生殖細胞(Embryonic germ cell,EG)分離與培養(yǎng)的影響因素進行了探討,為進一步建立牛和山羊EG細胞系奠定了基礎.實驗主要結果如下:(1)從49例牛胎兒分離培養(yǎng)胎兒原始生殖細胞(Primordial germ cell,PGC),胎齡在29~50d的牛胎兒可以用于分離培養(yǎng)原始生殖細胞,最高傳至7代.(2)統(tǒng)計46例山羊胎兒分離培

2、養(yǎng)原始生殖細胞情況,胎齡在25~38d的胎兒原代培養(yǎng)時都可獲得大量的細胞集落,適合做EG細胞的分離培養(yǎng),最高傳至6代.(3)用不同的飼養(yǎng)層培養(yǎng)牛原始生殖細胞,實驗結果表明MEF,STO和BEF飼養(yǎng)層都能支持牛原代PGCs的增殖,但MEF較BEF和STO效果更好(4)以MEF、GEF、BEF為飼養(yǎng)層,在不添加細胞因子情況下,都可以培養(yǎng)出原代山羊的胚胎生殖細胞.傳代結果表明,MEF的培養(yǎng)效果較好,但與GEF組二者差異不顯著(P>0.05),

3、BEF組培養(yǎng)效果較差(P<0.05).(5)以共培養(yǎng)方式培養(yǎng)牛、山羊原始生殖細胞,在原代培養(yǎng)時,都可以出現(xiàn)大量形態(tài)較好的EG細胞集落,說明同源的體細胞可以很好的支持PGC的生長和增殖.(6)試驗以三個不同濃度LIF的培養(yǎng)液培養(yǎng)山羊PGCs.在原代培養(yǎng)時,效果差異不顯著(P>0.05);而在傳代過程中,以含LIF 10 ng/mL組培養(yǎng)效果最好,但與含LIF5 ng/mL組差異不顯著(P>0.05),LIF 1 ng/mL組培養(yǎng)效果較差(

4、P<0.05).(7)試驗比較了不同消化方法對山羊胎兒原始生殖細胞分離的影響.在37℃下,0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA(處理20~30 min)消化分離效果較好于0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA(處理15 min)(8)試驗比較了不同傳代方法對牛和山羊胚胎生殖細胞細胞傳代的影響,發(fā)現(xiàn)消化+機械分離法和消化+吹打法都可以用于EG細胞的傳代.消化+吹打法操作簡單,省時省力,也能夠很好的保持細胞的增殖活力.(9)牛和山羊的胚