18823.大腸桿菌中mva途徑的構建及其產異戊二烯的研究

1、分類號：密級：UDC：學號：405604612026南昌大學碩士研究生學位論文大腸桿菌中大腸桿菌中MVA途徑的構建及其產異戊二烯的研究途徑的構建及其產異戊二烯的研究ConstructionoptimizationofthemevalonatepathwayinEscherichiacolifproductionofisoprene馮凡培養(yǎng)單位（院、系）：南昌大學生命科學院指導教師姓名、職稱：許楊教授申請學位的學科門類：理學學科專業(yè)名稱：

2、微生物學論文答辯日期：20150529答辯委員會主席：評閱人：年月日摘要I摘要摘要異戊二烯（C5H8）是一種重要的C5平臺化合物，是萜類化合物的基本組成單元。作為重要的化工原料，可用于合成與天然橡膠性能非常接近的生物橡膠。此外，異戊二烯還可應用于合成各種萜類化合物，廣泛應用于農藥、醫(yī)藥、香料及粘結劑等領域。隨著石油資源的日益枯竭，發(fā)展不依賴石油資源的生物基C5平臺化學品已成為實現(xiàn)經濟社會可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略需求。自然界中，異戊二烯和萜類化合

3、物都采用了相類似的合成途徑。即C甲基D赤蘚糖醇4磷酸途徑(MEPpathway)和甲羥戊酸代謝途徑(MevalonatepathwayMVApathway)。本研究通過在大腸桿菌中引入外源MVA途徑，成功的構建了產異戊二烯工程菌，并通過合成生物學和代謝工程手段對MVA途徑進行優(yōu)化，為異戊二烯的大規(guī)模生物合成提供了基礎。主要研究內容如下：1.異戊二烯產量氣相檢測方法的建立以異戊二烯標準品作為定量標準。系統(tǒng)采用AgilentTechbolo

4、gies7890AGCsystem型氣相色譜儀，色譜柱為HP55%phenylmethylsiloxan(30m320μm0.25μm)，檢測器為火焰離子化檢測器；氣化室溫度50℃，柱箱溫度240℃，檢測器溫度280℃。得到了異戊二烯產量與檢測峰面積的標準曲線。2.不同物種異戊二烯合成酶的克隆表達從蒙古櫟、斛櫟、麻櫟、遼東櫟、夏橡以及楊樹的基因組中克隆出異戊二烯合成酶基因構建了到表達載體pBADHisB中，分別與pYESs和pSPMIc

5、共轉化到E.coliBW25113得到重組菌，通過自誘導表達目的蛋白得到成功表達，其中BW01菌的異戊二烯的產量為451.4mgL。3.表達載體的優(yōu)化對于異戊二烯產量的提高對重組菌內的三個表達載體分別采用增加稀有密碼子AGA、使用不動強度啟動子以及改變表達載體拷貝數(shù)等方式調控關鍵基因在宿主菌內的表達，從而改變重組菌株產異戊二烯的能力，最優(yōu)的菌株BW12異戊二烯產量達到了1341.6mgL，比未優(yōu)化前提高了197.2%。4.遺傳背景的改造