番鴨呼腸孤病毒病診斷技術研究.pdf

1、番鴨呼腸孤病毒病主要發(fā)生于番鴨,夏季多發(fā),發(fā)病日齡以4~45日齡為主,發(fā)病率達20％~90％,應激或混合感染下,死亡率可達90％以上.國內(nèi)外未見有該病血清學診斷方法的報導.因此,臨床上建立一種切實可行且快速的診斷方法越來越受到國內(nèi)水禽養(yǎng)殖業(yè)的關注.該研究以此為出發(fā)點,建立了快速、簡便、準確,而且能夠在基層應用的間接ELISA檢測病毒抗體和反向乳膠凝集試驗檢測病毒抗原兩種血清學診斷方法.該課題以該實驗室分離鑒定保存的番鴨呼腸孤病毒B3分離

2、株為研究材料,開展了番鴨呼腸孤病毒病間接ELISA和反向乳膠凝集試驗兩種血清學診斷方法的研究與應用工作.1.采用番鴨胚成纖維細胞成功的培養(yǎng)了番鴨呼腸孤病毒,感染細胞產(chǎn)生了明顯的CPE病變,并進行病毒的擴大培養(yǎng),細胞培養(yǎng)物經(jīng)二次差速離心和硫酸銨沉淀制備了所需的診斷抗原,病毒蛋白含量為5.628mg/ml.2.采用細胞培養(yǎng)的番鴨呼腸孤病毒,按所設定的免疫程序免疫成年公番鴨,獲得瓊擴效價為1:16的陽性血清,經(jīng)粗提和純化獲得了蛋白含量為4.2

3、42mg/ml的一抗IgG.同時采集健康番鴨的血清,純化后獲得IgG,按所設定的免疫程序免疫家兔,獲得瓊擴效價為1:8的兔抗番鴨二抗血清,并純化得到蛋白含量為5.395mg/ml的二抗IgG.采用改良的過碘酸鈉法成功地把HRP標記在純化的二抗IgG上,結(jié)果表明,酶結(jié)合率=0.5312,標記率=0.6909,符合ELISA的要求.3.用硫酸銨粗提的番鴨呼腸孤病毒作為包被抗原和HRP酶標記的兔抗番鴨二抗,成功地建立了檢測番鴨呼腸孤病毒病抗體

4、的間接ELISA法.試驗結(jié)果表明,包被抗原1:80(0.0704mg/ml)稀釋,待檢血清1:40稀釋,酶標二抗1:200稀釋,是該方法最佳的工作濃度.應用研究結(jié)果表明,該法不與其它病原發(fā)生交叉反應,阻斷效果明顯,檢測番鴨呼腸孤病毒抗體可達1:800比瓊擴試驗高50倍,ELISA測定臨床采集的血清陽性率達70％,瓊擴試驗陽性率37.5％,兩者符合率67.5％,批內(nèi)批間重復結(jié)果穩(wěn)定.因此,間接ELISA法檢測番鴨呼腸病毒抗體特異性高、敏感

5、性強、重復性好、質(zhì)量穩(wěn)定、結(jié)果可靠,適合于臨床流行病調(diào)查.4.用純化的抗番鴨呼腸孤病毒抗體致敏乳膠成功地建立了反向乳膠凝集試驗檢測番鴨呼腸孤病毒抗原的方法.通過試驗,確定了抗體致敏乳膠的最佳濃度為0.4242 mg/ml,最佳致敏溫度37℃,最佳致敏時間2h.應用研究結(jié)果表明,抗體致敏乳膠無自凝性,特異性強,重復性好,質(zhì)量可靠.人工攻毒雛番鴨,用該方法可于攻毒后的第三天糞便中檢測到病毒抗原,直至攻毒鴨全部死亡都可從糞便中檢測到病毒,可見