苜蓿中華根瘤菌042BMnoeAB基因的克隆、表達(dá)調(diào)控和功能分析.pdf

1、采用三親本雜交方法,將帶有Tn5-1063(含luxAB)的質(zhì)粒pRL1063a導(dǎo)入苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042BM,進(jìn)行轉(zhuǎn)座子插入誘變,篩選到3個(gè)結(jié)瘤突變株042BMR5、042BMR11和042BRM29.它們都表現(xiàn)發(fā)光酶活性,表明轉(zhuǎn)座子正向插入到基因組中的某個(gè)啟動(dòng)子下游.對(duì)042BMR5突變株的基因組進(jìn)行反向PCR,擴(kuò)增位于Tn5-1063兩端的側(cè)翼序列.測(cè)序結(jié)果表明,該轉(zhuǎn)座子插入到noeB

2、基因內(nèi).根據(jù)基因組中noeB上游和下游序列擴(kuò)增出042BM noeB,其與苜蓿中華根瘤菌1021noeB的同源性為98﹪,而與NoeB蛋白的氨基酸序列相似性為95﹪.疏水性分析發(fā)現(xiàn),NoeB是一個(gè)跨膜蛋白,在N末端有4個(gè)跨膜區(qū),其中包含3個(gè)初級(jí)螺旋和1個(gè)次級(jí)螺旋.通過(guò)PCR擴(kuò)增,獲得了042BM的noeA基因.該基因與苜蓿中華根瘤菌1021noeA的同源性為99﹪,而與NoeA的相似性為97﹪.發(fā)現(xiàn)NoeA與中慢生根瘤菌(Mesorhi

3、zobium sp.)BNC1可能的SAM-依賴性的甲基轉(zhuǎn)移酶相似性為32﹪,而其303-362區(qū)域與大腸桿菌(Escherichia coli)的核糖體50S亞基的L11蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(PrmA)的160-220結(jié)構(gòu)域的相似性達(dá)到41﹪.由此推測(cè),NoeA對(duì)結(jié)瘤固氮作用的影響可能與基對(duì)L11蛋白的翻譯后甲基化修飾有關(guān).通過(guò)插入卡那盒,敲除noeA.與苜蓿中華根瘤菌042BM相比,敲除noeA的突變株042BMA-Km在普通紫花、保定、

4、寧夏、百發(fā)和傲漢苜蓿品種上的結(jié)瘤數(shù)、根瘤鮮重和植株地上部分的干重都有不同程度的增加,而在秘魯苜蓿品種上的結(jié)瘤數(shù)和植株地上部分的干重明顯下降,在皇后和美國(guó)雜花苜蓿品種上則沒(méi)有明顯的變化.該基因?qū)俎５慕Y(jié)瘤固氮能力表現(xiàn)出明顯的品種特異性.對(duì)noeAB基因進(jìn)行的表達(dá)調(diào)控研究發(fā)現(xiàn),葫蘆巴堿不能使noeAB的表達(dá)水平提高,證明它們的轉(zhuǎn)錄不受nodD2的調(diào)控.nodD3和syrM同時(shí)存在時(shí),noeAB的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的變化,表明它們也不受nodD

5、3-syrM系統(tǒng)的調(diào)控.毛地黃黃酮的誘導(dǎo)使noeAB基因的表達(dá)水平提高16倍,而在不添加毛地黃黃酮的TY培養(yǎng)基上,noeAB基因的表達(dá)水平也能夠提高30倍以上,說(shuō)明noeAB是受nodD1控制的,但除受毛地黃黃酮誘導(dǎo)外,還可能受到其他因子的調(diào)節(jié).對(duì)042BM-Km進(jìn)行的蛋白質(zhì)組初步分析發(fā)現(xiàn),noeA基因的敲除對(duì)蛋白質(zhì)合成水平具有多效性影響.引起至少15個(gè)蛋白質(zhì)合成水平發(fā)生了上調(diào),啟動(dòng)了至少28個(gè)新增蛋白的合成.另外,有一個(gè)蛋白點(diǎn)的合成發(fā)