26170.輔酶q,10高產(chǎn)菌株理性選育與發(fā)酵優(yōu)化

1、r_。。。?！?。。。。。。。。。?！徽獜膶嶒炇冶２鼐泻Y選到一株輔酶Qlo的產(chǎn)生茵XM023，產(chǎn)輔酶Q10達1880mg／L。首先通過菌落形態(tài)與細胞鏡檢觀察，以及液體培養(yǎng)與生理生化特征分析，初步判斷該菌為革蘭氏陰性菌，細胞富含色素，為典型的光合細菌。進一步采用16SrDNA分子鑒定技術，測定XM02316SrDNA序列，并構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹，最終確定該菌為類球紅細菌(Rhodobact

2、ersphaeroides)。以XM023為出發(fā)菌株，采用紫外線和LiCI兩輪誘變育種，篩選獲得耐對羥基苯甲酸、羅紅霉素的突變株XMII136，其輔酶Qlo產(chǎn)量為3179mg／L，較出發(fā)菌株提高6910％，突變株XMII136經(jīng)5次連續(xù)傳代培養(yǎng)，輔酶Q10產(chǎn)量保持在29mg／L33mg／L，結(jié)果表明XMII136是一株性狀較穩(wěn)定、可深入開發(fā)研究的優(yōu)良菌株。對XMII136進行輔酶Qlo發(fā)酵優(yōu)化，首先通過單因素篩選確定了培養(yǎng)基最佳碳源為葡

3、萄糖，氮源為玉米漿；最佳的發(fā)酵條件為：接種量10％，初始pH值68，裝液量50mL／250mL三角瓶；接著通過二水平PlackettBurman設計對培養(yǎng)基中的9種成分進行篩選，獲得影響發(fā)酵的3個重要成分：葡萄糖、谷氨酸、NaCl；再利用響應面分析法對該3組份進行3水平的優(yōu)化，獲得它們的最佳組合：葡萄糖342mg／L、谷氨酸242mg／L、NaCI198mg／L。通過以上優(yōu)化過程，輔酶Qlo最終發(fā)酵水平達到12921mg／L，比優(yōu)化前提

4、高了306％。通過分析XMII136輔酶Qlo搖瓶發(fā)酵的代謝過程，結(jié)果表明輔酶Q10合成與菌體生長為半耦聯(lián)過程?；贚ogistic方程和LuedekingPiret方程，構(gòu)建輔酶QIo發(fā)酵菌體生長、底物消耗、產(chǎn)物生成的動力學數(shù)學模型，對該動力學模型進行實驗擬合，求解相關動力學參數(shù)，最終獲得動力學數(shù)學方程。該數(shù)學方程與實驗數(shù)據(jù)能較好地吻合，較好地描述了XMII136輔酶Qlo搖瓶分批發(fā)酵過程。研究不同維生素對輔酶Qlo合成的影響，結(jié)果表

5、明：D胡蘿卜素效果最為明顯，比對照提高了323％。VBl、氯化膽堿、生物素分別比對照提高了112％、133％、108％：同時，實驗表明不同添加物的最適添加時間也不同：生物素、Bl在發(fā)酵初期添加較好；而D胡蘿卜素、氯化膽堿在發(fā)酵過程中添加效果較好。此外，向培養(yǎng)基中添加豆油發(fā)現(xiàn)，豆油對輔酶QIo合成有促進作用，其產(chǎn)量與對照相比提高了76％。對輔酶Qlo補料發(fā)酵進行研究，首先，在搖瓶條件下考察了葡萄糖補加時間、補加量和補加方式對輔酶Qlo的影

6、響，結(jié)果表明發(fā)酵36h補加糖液比發(fā)酵起始補糖效果要好，補加總糖量為309／L，少量多次補加可獲得最大輔酶Qlo產(chǎn)量21878mg／L。在AbstractAbstractIIIIllIllIIIllllUlIIlY1806878ThestrainXM023producingCoQl0wasscreenedfromstrainspreservatedinthelaboratory，itsfermentationlevelofCoQt0WaS

7、upto1880mg／LFirstthroughtheobservationofcolonymorphology，cellmicroscopy，liquidcultureandbiochemicalcharacteristics，itwasfoundthatthisstrainWaSgram—negativebacteriawithrichpigmentincell，whichWaSpreliminarilyjudgedtobeonet

8、ypicalofphotosyntheticbacteriaThe16SrDNAofstrainXM023wassequencedandanalyzedforsimilaritieswithrelatedbacterialspeciesResultsshowedthatstrainXM023WaSamemberoftheRhodobactersphaeroidesXM023beingastartingstrainwasmutageniz

9、edtwicewithUVandLiClByscreeneingthemutantsresistingPHBandroxithromycinid，amutantXMII136WaSObtained，theCoQl0productionreachedto3179mg／L，whichwas69。10％higherthantheoriginalstrainAfterfivetimesofcontinuousculture，theyieldof

10、themutantWaSremainedat29mg／L一33mg／LResultsshowedthattheobtainedmutantXMII136wasstablestrainthatwasworthwhiletobestudiedfurtherThefermentationoptimizationofXMII136wasstudiedThroughsinglefactortestofmutantXMII136，theresult

11、showedthatthebestcarbonWaSglucose，theoptimumnitrogmWaStomsteeppowder；thebestfermentationconditionwasobtainedbasedonthesinglefactortest，itshowedtheoptimalamountofinoculationwas10％，theoptimuminitialpHwas68andtheoptimalliqu

12、idvolumewere50mLculturein250mLshakeflasksAP1ackett—Bunnandesignwasusedtoselect3importantfactorsfrom9impactfactorswhichaffectedCoQl0fermentationinculturemediumTheywereglucose，NaClandglutamicacidTheoptimumcomponentsobtaine

13、dbytheresponsesurfaceanalysismethod(RSM)wereglucose3429／L，NaCl2429／L，glutamicacid1989／LAftertheseoptimization，thefermentationlevelofXMII136reached12921mg／L，whichwas306％higherthanthatofnonoptimizedfermenatationBasedonthes