26489.富含甘油三酯脂蛋白致泡沫細(xì)胞的蛋白組學(xué)研究

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文富含甘油三酯脂蛋白致泡沫細(xì)胞的蛋白組學(xué)研究姓名：魯艷軍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：屈伸201005華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文4進(jìn)一步測(cè)定胞內(nèi)脂質(zhì)成分，結(jié)果提示：VLDL孵育形成的泡沫細(xì)胞內(nèi)主要以TG堆積為主，表明富含TG的泡沫細(xì)胞模型已建立。下一步，提取上述富含TG的泡沫細(xì)胞的總蛋白，通過(guò)二維電泳技術(shù)分離其蛋白質(zhì)組，建立了富含TG的泡沫細(xì)胞的二維圖譜。對(duì)二維圖譜進(jìn)行

2、ImageMaster軟件分析結(jié)果顯示：每張圖譜可檢測(cè)到1000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)左右，大部分蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)集中在PH57。VLDL處理組與PBS處理組的蛋白質(zhì)組表達(dá)量比較分析，114個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，101個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明巨噬細(xì)胞在吞噬VLDL形成泡沫細(xì)胞中，可能有大量蛋白質(zhì)表是參與其病理過(guò)程。其次，為進(jìn)一步鑒定上述蛋白質(zhì)組中的差異蛋白質(zhì)，我們?cè)谀z上手工切取差異點(diǎn)，然后經(jīng)胰蛋白酶解，將上述酶解的片斷經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛

3、行時(shí)間質(zhì)譜分析(Matrixassistedlaserdesptionionizationtimeofflight–massspectrometry，MALDITOFMS)分析，獲得了蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋圖譜(petidemasfingerprint，PMF)，然后搜索基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的定性鑒定。其中14個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)通過(guò)質(zhì)譜分析被鑒定，其中包括與泡沫細(xì)胞中脂滴形成密切相關(guān)的蛋白質(zhì)脂肪分化相關(guān)蛋白(Adiposediff

4、erentiationrelatedprotein，ADRP)，磷酸甘油酸變位酶等參與糖酵解以及參與氧化應(yīng)激等蛋白質(zhì)，同時(shí)我們通過(guò)WesternBlot驗(yàn)證部分蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，其結(jié)果與蛋白質(zhì)組結(jié)果一致，并通過(guò)RTPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)上述蛋白質(zhì)在mRNA水平上已發(fā)生變化。上述結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞泡沫化的過(guò)程中，不僅大量脂質(zhì)堆積，可能伴隨著復(fù)雜的生物學(xué)變化如糖代謝，氧化應(yīng)激的變化等。另外，本文首次將熒光差異凝膠電泳(Differenceingel

5、electrophesisDIGE)技術(shù)應(yīng)用于富含TG的泡沫細(xì)胞研究。由于DIGE可以將不同的標(biāo)本標(biāo)記不同的熒光染料，混合后在同一次二維電泳過(guò)程中進(jìn)行等電聚焦和SDSPAGE電泳，重復(fù)性好、靈敏度高，目前已作為蛋白質(zhì)組定量研究的工具之一。在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)將提取的各組細(xì)胞總蛋白各50g分別用Cy3，Cy5標(biāo)記，各樣品組的等量混合物用Cy2標(biāo)記作內(nèi)標(biāo)，凝膠匹配率達(dá)93%，經(jīng)分析表達(dá)量上調(diào)1.5倍以上有94個(gè)，表達(dá)量下調(diào)1.5倍以上有