人TPO基因牛體細胞定點整合載體構建與細胞轉染研究.pdf

1、 該研究主要探討人TPO基因牛體細胞定點整合載體構建及其進行細胞轉染的可行性.參照奶牛、綿羊、山羊等的β-酪蛋白序列設計了一對引物P1、P2,以本地水牛和內蒙古綿羊基因組為模板,采用高保真Ex Taq酶,擴增得到水牛、綿羊β-酪蛋白基因的5′調控區(qū)序列(分別長4.5Kb、4.1Kb).將擴增產(chǎn)物克隆到pMD-18T上,經(jīng)酶切分析、部分序列測定和同源比較確認得到了所需的基因片段.測序結果與水牛和綿羊的相應序列同源性分別達到98％(833b

2、p)、98%(735bp).利用已克隆的TPO基因(5.5Kb)、奶牛as1-酪蛋白基因同源臂序列(6.0Kb和1.78Kb)、水牛和綿羊β-酪蛋白5′調控區(qū)序列和ploxp質粒骨架,經(jīng)多步酶切-連接-轉化-篩選-鑒定基因重組過程(連接片段不經(jīng)過脫磷酸化處理),最終建成兩個人TPO基因牛體細胞打靶載體:ploxp-6.0-BβCN-TPO-1.78和ploxp-6.0-SβCN-TPO-1.78,長達25Kb.采用PCR和酶切分析對構建

3、載體進行全面驗證,確認得到了設計的打靶載體.采用脂質體法,將線性化的打靶載體ploxp-6.0-SβCN-TPO-1.78導入體外培養(yǎng)到第3代的奶牛成纖維細胞,采用G418+GANC進行篩選,篩選到第24天時,得到抗性細胞.結果表明:(1)應用LA-PCR技術,采用高保真Ex Taq酶能擴增得到綿羊和水牛beta-casein基因的5′調控區(qū)序列.(2)綿羊、水牛β-酪蛋白基因的5′調控區(qū)(啟動子)、人血小板生成素(TPO)基因(目的基