大豆種子特異性啟動(dòng)子的克隆與功能研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)理論和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為一種新型農(nóng)業(yè)技術(shù),全球性生物農(nóng)業(yè)的大發(fā)展是大勢(shì)所趨.但是,目前的植物基因工程技術(shù)也有不少不足之處,如表達(dá)量低、遺傳不穩(wěn)定和基因沉默等,為了克服這些缺點(diǎn),進(jìn)行了多方面的探索和研究,提出了多種改進(jìn)和完善植物基因工程技術(shù)的方法和策略.這些方法和策略中,種子特異性啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用是改進(jìn)植物基因工程技術(shù)的一項(xiàng)重要環(huán)節(jié).所謂的種子特異性啟動(dòng)子是指只有在種子成熟的中、后期啟動(dòng)下游基因,

2、在種子組織中特異性地、大量轉(zhuǎn)錄和表達(dá)其下游基因的啟動(dòng)子.種子特異性啟動(dòng)子一般來(lái)自種子或胚乳中富含的貯藏蛋白基因的啟動(dòng)子.大豆β-伴球蛋白是大豆種子貯藏蛋白的重要組成部分.大豆β-伴球蛋白由α-、α′-和β-亞基等三個(gè)亞基組成.該研究通過(guò)PCR方法從大豆品種~吉林43基因組DNA中分離到大豆β-伴球蛋白α-亞基基因啟動(dòng)子片段(BCSP501),并對(duì)此片段進(jìn)行TAILPCR延伸,獲得了啟動(dòng)子片段BCSP666.序列分析表明,啟動(dòng)子片段BCS

3、P666中含有種子特異性啟動(dòng)子所需的啟動(dòng)子序列元件:TATA盒、CAAT盒外、A/T富含序列元件、RY重復(fù)序列元件、AGCCCA序列元件、TACACAT序列元件、ACGT序列元件、E盒等多種多拷貝的序列元件.據(jù)此推測(cè)該啟動(dòng)子片段具有種子特異性啟動(dòng)子活性.以該片段構(gòu)建種子特異性表達(dá)GUS基因的植物載體pBI121-666,以花蕾轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化擬南芥,轉(zhuǎn)基因擬南芥中的GUS酶熒光光度分析和組織化學(xué)檢測(cè)均表明,GUS基因在啟動(dòng)子片段BCSP66

4、6調(diào)控下獲得了種子特異性表達(dá).再以BCSP666為基礎(chǔ),通過(guò)TAIL PCR方法再次延伸而獲得啟動(dòng)子片段BCSP952,并與其它12種種子特異性啟動(dòng)子序列進(jìn)行了序列對(duì)比分析,進(jìn)一步證實(shí)了BCSP952的種子特異性啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn).這是首次對(duì)大豆β-伴球蛋白α-亞基基因啟動(dòng)子進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析和種子特異性功能鑒定.同時(shí),通過(guò)PCR技術(shù)從大豆品種~吉林43基因組DNA中分離到大豆β-伴球蛋白α′-亞基基因啟動(dòng)子片段(BCSP408).序列分