ggA-miR-155抑制傳染性法氏囊病病毒復(fù)制的分子機(jī)理.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectiou Bursal Disease，IBD)由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起，主要侵害雛雞淋巴組織，特別是法氏囊。該病不僅導(dǎo)致患病動(dòng)物死亡，而且還可導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制。microRNA(miRNA)是一種非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約21-25nt，能在轉(zhuǎn)錄后降解靶基因mRNA或抑制基因的翻譯，在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平上對(duì)生理和病理過(guò)程起重要的調(diào)控作用

2、。gga-miRNA-155在傳染性法氏囊病毒(IBDV)感染雞胚成纖維細(xì)胞CEF和SPF雞的病料被檢測(cè)到表達(dá)差異顯著。本文運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、Western Blot、qRT-PCR等分子生物學(xué)技術(shù)以及生物信息學(xué)方法，探究gga-miR-155對(duì)IBDV的復(fù)制的影響，并探究其作用的分子機(jī)理。研究包括兩個(gè)部分:
　　1、gga-miR-155對(duì)IBDV復(fù)制和細(xì)胞IFN表達(dá)的影響
　　首先合成gga-miR-155的模擬物

3、gga-miR-155 mimics，轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后接種IBDV，分別在24h、48h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，測(cè)定IBDV的病毒滴度，結(jié)果顯示，gga-miR-155 mimics能夠顯著抑制IBDV的復(fù)制。為進(jìn)一步探究其抑制IBDV復(fù)制的分子機(jī)理，對(duì)病毒感染后的Ⅰ型干擾素(IFN)檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型IFN的表達(dá)上調(diào)。由此表明gga-miR-155抑制IBDV復(fù)制的分子機(jī)理是通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞天然免疫功能而發(fā)生的。
　　2、gga-mi

4、R-155抑制IBDV復(fù)制的分子機(jī)理
　　生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)gga-miR-155的靶點(diǎn)，并在miRDB中g(shù)ga-miR-155的眾多靶基因中選取SOCS1基因。SOCS1是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，對(duì)機(jī)體固有免疫以及適應(yīng)性免疫起到重要的調(diào)控作用，可能與miR-155對(duì)IBDV的抑制作用有關(guān)，分別在mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證。將SOCS1 mRNA3'UTR克隆至熒光素酶報(bào)告載體，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)中實(shí)驗(yàn)組熒光素酶活性

5、降低。qRT-PCR分析gga-miR-155 mimics轉(zhuǎn)染的DF-1細(xì)胞中SOCS1 mRNA水平比對(duì)照組顯著降低。將SOCS1 mRNA編碼區(qū)及其3'UTR克隆至pEGFP-N1-Flag標(biāo)簽載體中，構(gòu)建Flag與SOCS1共表達(dá)真核質(zhì)粒，將其與gga-miR-155 mimics共轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞并接毒IBDV，Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明Flag蛋白表達(dá)下調(diào)，也即SOCS1蛋白表達(dá)被抑制。以上結(jié)果表明，gga-miR-