青霉素菌渣堆肥工藝及青霉素抗性基因的分布影響研究.pdf

1、中國是抗生素的生產和使用大國，以青霉素為例，其生產和使用量在國內始終居于首位。青霉素生產過程中產生大量的菌渣，因其富含高蛋白，具有資源化回收或利用的可能，但菌渣中含有一定量的青霉素及其代謝產物，若處置不當，易引發(fā)抗生素抗性菌及抗性基因的誘導和富集，對環(huán)境和人類健康造成潛在威脅。本研究采用高溫好氧堆肥工藝，將青霉素菌渣與豬糞混合堆肥處理，以期消除菌渣中的青霉素殘留，實現(xiàn)菌渣的“變廢為寶”，同時探討青霉素菌渣堆肥過程中β-內酰胺酶基因型菌群

2、的誘導富集效應，評價青霉素菌渣堆肥化處置的安全性。
　　本研究以豬糞和青霉素菌渣為原料，以碎木屑為調節(jié)劑進行為期30d的高溫好氧堆肥，整個堆制過程在江蘇省南京市蔬菜科技園完成。堆肥過程中設置4個處理:處理1，豬糞∶青霉素菌渣=1∶1;處理2，豬糞∶青霉素菌渣=2∶1;處理3，豬糞∶青霉素菌渣=4∶1;對照組，純豬糞。通過檢測堆體的物理學、化學、生物學指標，對比分析不同青霉素菌渣添加比例對堆肥腐熟度的影響;基于實時熒光定量PCR(R

3、eal-time PCR)研究方法，對β-內酰胺酶A（bla-TEM、bla-CTX-M-1、bla-CTX-M-9）、B(bla-IMP-1、bla-VIM-2、bla-NDM-1)、C(bla-CMY)、D(bla-OXA-23)四類基因進行絕對定量，初步探討青霉素菌渣堆肥過程中β-內酰胺酶基因型菌群的演變過程;篩選青霉素降解菌，分析其降解特性，評價其成為青霉素菌渣堆肥菌劑的可行性。主要研究結論如下:
　　經過30d的堆制過程

4、，4個處理組物理學、化學和生物學指標均顯示堆肥已腐熟，對比處理組和對照組堆肥理化參數(shù)發(fā)現(xiàn)，添加青霉素菌渣有助于延長堆肥的高溫期。堆肥結束后，各處理的堆體溫度接近室溫，堆料顏色變?yōu)樯詈稚?，堆體體積減小并變得松散，開始出現(xiàn)土腥味;pH值分別為7.3、7.4、7.3和7.9，EC值分別為6.3、5.5、5.3和4.3ms/cm;有機碳含量分別下降了14.1％、19.7％、17.7％和27.1％，總氮含量分別下降了27.4％、14.0％、4.4

5、％和16.5％;發(fā)芽指數(shù)(GI)均超過80％，均達到了堆肥無植物毒性標準。
　　高溫好氧堆肥方式可以有效降解青霉素菌渣中的青霉素殘留。運用超高效液相色譜(UPLC)法測定處理1、2、3的青霉素殘留濃度，分別由初始的（305.1±16.8）mg/kg、（208.6±4.2）mg/kg和（74.9±3.0）mg/kg降至濃度低于UPLC方法檢測限。各個處理的青霉素降解均符合一級反應動力學模型，處理1青霉素鈉的降解速率常數(shù)（k）為0.3

6、d-1，降解半衰期(t1/2)為1.9d;處理2青霉素鈉的k為0.2d-1，t1/2為2.4d;處理3青霉素鈉的k為0.2d-1，t1/2為2.3d，與常溫(25℃)下青霉素標準品的降解半衰期(39.4d)相比，堆肥化處理大大縮短了青霉素的降解時間。
　　高溫好氧堆肥過程對不同處理組的β-內酰胺酶不同基因型數(shù)量都有一定消減作用。堆肥結束(30d)后，4個處理中bla-TEM基因數(shù)量與初始(0d)相比分別減少了69.4％、53.3％

7、、67.9％和51.7％;bla-CTX-M-1基因數(shù)量與初始相比分別減少了93.4％、98.8％、98.9％和84.6％;bla-CTX-M-9基因數(shù)量與初始相比分別減少了99.0％、99.9％、99.9％和99.7％。bla-IMP-1基因數(shù)量在處理1和處理2堆制結束分別增加至初始值的21.8和16.3倍，而處理3和對照組中bla-IMP-1基因數(shù)量與初始相比分別減少了99.8％和72.6％。處理1和處理3中bla-VIM-2基因數(shù)

8、量在堆肥結束后有所上升，分別增加為原來的0.7和4.0倍，處理2和對照組分別減少了99.8％和78.3％。bla-CMY基因數(shù)量在處理1、2、3堆制過程中呈下降趨勢，至堆肥結束分別減少了80.5％、43.6％和88.3％。堆肥結束后，處理1和處理2中已檢測不到bla-OXA-23基因，而處理3和對照組中該基因數(shù)量與初始相比分別減少了80.2％和74.3％。整個堆肥期間，各個處理樣品中均未檢測到bla-NDM-1基因。
　　通過平板

9、劃線法從處理組篩選出一株青霉素高效降解新菌，命名PC-2T，已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC1.15283)。經分子生物學鑒定，菌株PC-2T屬螯合球菌屬（Chelatococcus sp.）。經形態(tài)學及革蘭氏染色觀察，菌株PC-2T是革蘭氏陰性菌，在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈圓形，乳白色，表面光滑，中間有凸起，不透明，邊緣整齊，直徑約為1～2mm。在掃描電子顯微鏡下觀察為短桿狀，寬約為0.8～1.0μm，長約為1.8～2

10、.8μm。主要脂肪酸為C18∶1 w7c(50.7％)和C19∶0 cyclo w8c(22.3％)。經HPLC法測得的G+C mol％含量為70.9mol％。當葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、接種量為14％、pH為6～8時，菌株PC-2T在37℃下振蕩培養(yǎng)6h，對底物濃度為400mg/L的青霉素鈉的降解率達98％以上。
　　青霉素菌渣堆肥產品各理化指標及生物學指標已達腐熟標準，能夠用于農業(yè)生產。高溫好氧堆肥過程對典型的幾類β-內酰胺