高溫脅迫下番茄Solexa轉錄組測序及LeCOR413-TM1基因克隆和功能分析.pdf

1、溫度脅迫是影響番茄作物產(chǎn)量及地域分布的主要限制因子之一，通過基因工程手段提高植物的抗性，培育耐高溫或耐低溫番茄品種是有效緩減溫度脅迫的重要途徑之一。
　　本實驗通過Solexa高通量測序，對高溫脅迫處理前后的番茄植株進行轉錄組測序，分析了受高溫脅迫上調和下調表達的基因，揭示了番茄高溫脅迫下轉錄組水平的復雜的調控網(wǎng)絡。同時，從Solexa測序下調的基因中篩選出一個番茄冷調節(jié)(Cold-regulated gene，COR)家族同源基

2、因，并從番茄品種中蔬6號葉片中分離到該基因，命名為LeCOR413-TM1，對其序列特征、表達模式以及轉基因煙草的抗逆生理功能進行了研究。主要結果如下:
　　(1)高溫處理番茄植株，用Solexa技術進行序列測定，處理前后分別檢測到4661314和4981634個有信號的探針，各包含了186280和226513個特異性標簽。去除假陽性標簽后，分別獲得了4563284和4862014個清晰標簽。通過比對番茄基因數(shù)據(jù)庫，分別找到了33

3、02958(72.38％)和3211809(66.06％)個匹配的標簽。我們以log2值（變化倍數(shù)）＞2和＜-2、P-value值（統(tǒng)計學有效值）＜0.001、FDR（錯誤發(fā)生率）＜0.01作為篩選基因的標準，找到了284個上調基因和154個下調的基因，主要參與環(huán)境應答的有36個上調和28個下調基因，參與轉錄調控的有108個上調和36個下調基因，參與代謝的有53個上調和58個下調基因;其中未知基因約占18.9％。
　　(2)利用同

4、源序列設計引物，通過RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到全長cDNA，命名為LeCOR413-TM1(AW034114)。該基因全長為726bp，開放閱讀框663bp，編碼221個氨基酸。qRT-PCR結果表明，LeCOR413-TM1在葉中表達量最高;同時，該基因的表達受4℃、PEG、ABA及強光誘導。
　　(3)將p35S-LeCOR413-TM1-GFP融合蛋白在煙草體中瞬時表達。通過Confocal觀察到GFP激發(fā)的綠色熒光

5、和葉綠素的紅色自發(fā)熒光完全重合，說明LeCOR413-TM1基因產(chǎn)物定位于葉綠體。
　　(4)將獲得的LeCOR413-TM1基因與含有35S啟動子的pBI121載體重組，構建了正義過表達載體，通過農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉化煙草，用PCR和qRT-PCR的方法對轉基因煙草植株進一步檢測，結果證明成功地獲得了轉正義的煙草植株。
　　(5)在低溫(4℃)脅迫條件下，與野生型相比較，轉基因煙草的種子萌發(fā)和幼苗的生長情況均好于野生型。這