白粉病菌誘導(dǎo)小偃麥異附加系SN6306差異表達(dá)基因的克隆與功能分析.pdf

1、小麥白粉病是由禾本科布氏白粉菌小麥專(zhuān)化型Blumeria graminis f.sp.tritici(Bgt)引起的氣傳性病害。在我國(guó)，自從上世紀(jì)90年代初兩次白粉病大流行后，小麥白粉病的發(fā)病面積都處在較高的水平上，已成為小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要限制因素之一。由于在較短時(shí)間內(nèi)小麥白粉病菌就能突變成新的生理小種并且含單一抗性基因品種會(huì)在短期內(nèi)抗性減弱甚至喪失，因此發(fā)掘與利用新的抗病基因、培育具多抗病基因聚合的并持久抗病的品種具重要意義。本研究

2、以高感白粉病菌生理小種E09小麥品種YN15及其與中間偃麥草的雜交后代高抗白粉病菌生理小種E09小偃麥異附加系SN6306為研究對(duì)象，采用GeneFishing-PCR與RNA-seq技術(shù)對(duì)小麥白粉病菌E09誘導(dǎo)后的SN6306與YN15中的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選。主要結(jié)果如下:
　　(1) GeneFishing-PCR技術(shù)篩選差異基因
　　利用GeneFishing-PCR對(duì)SN6306與YN15白粉菌誘導(dǎo)前后的cDNA序

3、列進(jìn)行篩選，選取SN6306在白粉菌誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)的差異條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，得到與基礎(chǔ)代謝(38.6％)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(1.6％)、轉(zhuǎn)錄翻譯(11.8％)、蛋白合成(5.5％)、抗生物脅迫(11.8％)及抗非生物脅迫(11.0％)有關(guān)的127個(gè)EST序列。
　　(2)小麥TaARP1基因的克隆及功能初步分析
　　在GeneFishing-PCR獲得的SN6306在白粉菌誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)結(jié)果中，經(jīng)過(guò)分析得到69B1為編碼TaARP1的

4、序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度分別為751 bp的cDNA與1072 bp的DNA序列，含有長(zhǎng)度為181bp和140bp的兩個(gè)內(nèi)含子區(qū)，開(kāi)放閱讀框?yàn)?48bp，編碼115個(gè)氨基酸殘基。TaARP1與大麥、粗山羊草、短柄草等單子葉植物中的ARPs相似，進(jìn)化上同源。qRT-PCR結(jié)果顯示，該基因在白粉菌誘導(dǎo)后比未誘導(dǎo)對(duì)照上調(diào)表達(dá)了約10倍。BSMV-VIGS結(jié)果顯示，該基因的短暫沉默，白粉病菌侵染后的小麥葉片的病斑比未沉默的對(duì)照葉片的病斑大，說(shuō)

5、明其可能在響應(yīng)白粉病菌的過(guò)程中起作用。
　　(3)小麥TaTGA4基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　在GeneFishing-PCR獲得的SN6306在白粉菌誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)結(jié)果中，經(jīng)過(guò)分析得到36113為編碼TaTGA4拘序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為1444 bp的cDNA序列，預(yù)測(cè)編碼區(qū)長(zhǎng)度為1221 bp，編碼含有406個(gè)氨基酸殘基的蛋白。該蛋白含有bZIP1superfamily與DOG1 superfamily保守結(jié)構(gòu)

6、域，與節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii)TGA4的一致性(identities)達(dá)到92％，與烏拉爾圖小麥（Triticum urartu）TGA4的一致性(identities)達(dá)到90％。多序列聯(lián)配及系統(tǒng)發(fā)育分析得出小麥與節(jié)節(jié)麥和烏拉爾圖小麥的親緣關(guān)系較近，進(jìn)化上有一定的同源關(guān)系。
　　(4) RNA-seq技術(shù)篩選差異基因
　　對(duì)白粉菌誘導(dǎo)后SN6306與YN15不同時(shí)間點(diǎn)各自的混合樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。首先，

7、選取在YN15中讀數(shù)為0(Read B=0)的7個(gè)差異表達(dá)基因序列進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的測(cè)序結(jié)果與RNA-seq測(cè)序的結(jié)果一致，可以確信RNA-seq序列的準(zhǔn)確性，而且以基因組DNA為模板的擴(kuò)增表明，有6條序列在SN6306及中間偃麥草中獲得了擴(kuò)增產(chǎn)物且序列高度相似。其次選取YN15中讀數(shù)約為0(Read B≈0)的39個(gè)差異表達(dá)基因在白粉病菌誘導(dǎo)下的表達(dá)情況進(jìn)行分析。這39個(gè)差異表達(dá)基因在YN15中的表達(dá)量基本沒(méi)有或者很少，而在S

8、N6306中表達(dá)，推測(cè)這些基因很有可能來(lái)源于其親本中間偃麥草。其中12個(gè)基因表現(xiàn)出白粉病誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，上調(diào)表達(dá)量是對(duì)照的3倍至45倍不等。這些上調(diào)表達(dá)的基因編碼的產(chǎn)物中，主要是蛋白酶以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，包含內(nèi)部柯巴基二磷酸合酶（ent-copalyl diphosphate synthase，ent-CPS）、豬籠草天冬氨酸蛋白酶（Aspartic proteinase nepenthesin）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serin