馬鈴薯液泡酸性轉化酶基因的表達調控機制研究.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界第四大糧食作物。中國是馬鈴薯第一生產大國，馬鈴薯消費正由鮮食為主逐漸向高附加值產品轉變。為了延長市場供應期，通常將收獲后的馬鈴薯塊莖貯藏在低溫條件下，而低溫貯藏過程中塊莖還原糖含量上升，造成馬鈴薯加工品質下降。因此，明確低溫糖化的調控機制是馬鈴薯品質研究的難點與熱點。前人研究顯示，低溫條件下轉化酶活性上升是造成低溫糖化的主要因素。但關于轉化酶基因（StvacINV1）在馬鈴薯塊莖低

2、溫貯藏中的表達調控機制還不完全明確。
　　 本研究基于本實驗室前期的工作，通過克隆分析StvacINV1基因的啟動子，同時通過分析miRNA及其靶基因，以明確StvacINV1的轉錄調控和轉錄后調控機制。主要研究結果如下:
　　 1.StvacINV1基因在抗低溫糖化和低溫糖化敏感型基因型中的表達模式
　　 研究選用6個馬鈴薯基因型作為材料，分析不同基因型的低溫糖化敏感程度和StvacINV1表達模式。結果顯示，

3、20℃條件下所有基因型在整個貯藏期間的炸片色澤、還原糖含量和蔗糖含量變化幅度較小，但在4℃條件下貯藏的塊莖，所有基因型炸片色澤隨貯藏時間的延長而逐漸加深，還原糖含量和蔗糖含量上升。色澤指數分析顯示，抗低溫糖化基因型ND860-2、10908-06、CW2-1薯片色澤指數上升幅度較小;而低溫糖化敏感基因型11059-01、ED25和E3薯片色澤指數上升幅度較大。可溶性酸性轉化酶活性和StvacINV1轉錄本豐度分析顯示，可溶性酸性轉化酶活

4、性在4℃貯藏5d-15d之間上升，而StvacINV1轉錄本豐度則在4℃貯藏8h-16h即開始上升。低溫貯藏后，StvacINV1轉錄本豐度均高于20℃貯藏的水平，且在栽培種中抗低溫糖化基因型和低溫糖化敏感基因型間StvacINV1基因的表達模式無規(guī)律性的差異。但野生種S.berthaultii(CW2-1)的StvacINV1基因表達水平在低溫貯藏5d時明顯低于栽培種，暗示該基因型中StvacINV1基因在轉錄水平的調控可能影響其低溫

5、糖化性狀。
　　 2.StvacINV1基因啟動子克隆與功能分析
　　 為了明確StvacINV1基因在不同基因型中的表達是否與啟動子結構有關，實驗選用10個馬鈴薯基因型，采用高效熱不對稱PCR技術克隆了StvacINV1基因的啟動子。測序結果顯示，來自馬鈴薯不同基因型的啟動子序列一致性為94.1％-99.9％，其結構上沒有規(guī)律性的差異。生物信息學分析顯示，StvacINV1基因啟動子序列上有9個糖抑制元件、8個赤霉素應

6、答元件。進一步轉基因分析表明，該啟動子可驅動報告基因在根、莖、葉以及塊莖中表達，蔗糖、葡萄糖、果糖抑制啟動子活性，而赤霉素和生長素可促進啟動子活性。啟動子缺失實驗證明，該啟動子應答蔗糖/葡萄糖、赤霉素、生長素的啟動子區(qū)域分別為-118至-551、-551至-1021，以及-1021至-1521。在本研究中，低溫能夠抑制StvacINV1基因啟動子活性，與該基因的表達模式存在明顯的差異，暗示該基因的表達水平可能受到其它因素的影響，如轉錄后

7、調節(jié)。
　　 3.低溫糖化相關的miRNA及其靶基因分析
　　 研究以抗低溫糖化基因型10908-06為材料，分別構建了塊莖4℃和20℃貯藏條件下的small RNA文庫和降解組文庫。通過高通量測序和分析，共獲得53個knownmiRNA、60個novel miRNA、70個miRNA*以及70個靶基因。以測序信息為基礎的分析結果表明，36個miRNA/miRNA*在不同貯藏溫度條件下呈現差異表達。進一步選擇了24個mi

8、RNA/miRNA*和55個靶基因通過RT-qPCR進行表達分析，結果顯示，共有12 miRNA/miRNA*和11個靶基因在4℃和20℃以及抗低溫糖化和低溫糖化敏感型基因型間表達水平差異顯著。
　　 12個表達差異顯著的miRNA/miRNA*與已進行RT-qPCR分析的靶基因比較分析，有6個miRNA/miRNA*可以匹配上11個靶基因。這11個靶基因中，有3個靶基因在在兩個溫度及兩個基因型間的表達差異達到顯著水平，3個靶基

9、因涉及1個miRNA(miR172)和1個miRNA*(miR396a-3p)。miRNA/miRNA*及其靶基因的對比分析證明，miR172在抗低溫糖化基因型中，塊莖低溫貯藏2d顯著上調表達，其匹配的靶基因在同一處理的時間內下調表達，靶基因呈現明顯的miRNA調控關系。miR396a-3p與其靶基因未呈現明顯的調控表達模式。
　　 在本研究中，miRNA/miRNA*未發(fā)現轉化酶靶基因，同時，StvacINV1的轉錄本水平與馬