電轉(zhuǎn)染制作廣西巴馬小型豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎.pdf

1、我國是一個養(yǎng)豬大國,同時也具有豐富的地方特色豬品種。但是許多優(yōu)秀地方特色豬種并沒有充分得到利用,其開發(fā)利用和發(fā)掘的潛力是非常巨大的,廣西巴馬小型豬作為我國特有的一種小型豬品系,其遺傳及表型特征穩(wěn)定,同時在生理和解剖學(xué)等方面與人類相似,已被用于外科訓(xùn)練、藥物評價及人類異種皮膚移植試驗。開展廣西巴馬小型豬轉(zhuǎn)基因克隆研究不僅有效保存地方豬的優(yōu)秀遺傳特性,而且還為人類生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供理想的動物模型,有助于提升地方豬的應(yīng)用范圍和價值。因此以廣西

2、巴馬小型豬為研究對象是一種理想生物和醫(yī)學(xué)模型。
　　本研究采用胰蛋白酶法制備新生廣西巴馬小型豬腎臟成纖維細胞,建立巴馬小型豬腎臟成纖維細胞體系。以PEGFP-N1質(zhì)粒用于電轉(zhuǎn)染成纖維細胞并優(yōu)化電轉(zhuǎn)染參數(shù),在優(yōu)化的電轉(zhuǎn)染參數(shù)下轉(zhuǎn)染成纖維細胞并成功篩選出陽性成纖維細胞。以篩選出的轉(zhuǎn)基因成纖維細胞為供體細胞,成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。通過胚胎移植來進一步在體內(nèi)驗證轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的發(fā)育能力,并嘗試為構(gòu)建存活的轉(zhuǎn)基因克隆豬提供了支持。為構(gòu)建

3、轉(zhuǎn)基因克隆胚胎,我們開展了如下試驗:
　　實驗一、以巴馬小型豬新生豬仔為材料,采用胰蛋白酶消化法來建立巴馬小型豬腎臟成纖維細胞體系。并成功獲得了豬腎臟成纖維細胞用于核移植的供體細胞。
　　實驗二、探索電壓對巴馬小型豬腎臟成纖維細胞的存活率的影響。分別以0、80、100、120、140、160的電壓對成纖維細胞進行電擊,發(fā)現(xiàn)細胞隨著電壓的增加,細胞存活率下降,在120V的電壓下細胞的存活率為大約為50％。
　　實驗三、摸

4、索巴馬小型豬腎臟成纖維細胞電穿孔轉(zhuǎn)染條件。采用電轉(zhuǎn)儀對小型豬腎臟成纖維細胞進行電轉(zhuǎn)pEGFP-N1質(zhì)粒,分別以0、80、100、120、140、160的電壓對成纖維細胞進行電擊,發(fā)現(xiàn)細胞隨著電壓增加,細胞轉(zhuǎn)染率上升,以電擊后的細胞存活率、發(fā)熒光比例為綜合考慮來判定電轉(zhuǎn)染參數(shù)優(yōu)劣。在電壓對細胞的存活率的影響和電壓對細胞轉(zhuǎn)染效率的雙重影響下,發(fā)現(xiàn)選擇在電壓120V,脈沖時程20ms,脈沖次數(shù)為2次(間隔1min)時為最佳的電轉(zhuǎn)染參數(shù)。