玉米原位轉化體系建立及轉化機制初步分析.pdf

1、近年來農桿菌介導的植物原位(InPlanta)轉基因技術體系已廣泛用于擬南芥、白菜、油菜、苜蓿等多種植物的轉化中,但在單子葉植物玉米上的應用少見報道。本研究以玉米骨干自交系鄭58作為轉化受體材料,應用正交實驗設計,研究建立玉米原位轉化體系并進行技術參數優(yōu)化;同時利用GUS報告基因的瞬時表達技術分析了玉米原位轉化中農桿菌侵染途徑及位置等。獲得如下主要結果:
　　1.初步建立了玉米原位轉化體系,主要流程如下:A.農桿菌培養(yǎng)及轉化液制備

2、;B.原位轉化:在玉米初花期(雌穗花絲露出苞葉3-5cm,雄穗未散粉),將農桿菌菌液注入雌穗,待成熟期收獲種子;C.除草劑抗性篩選:將收獲的T0代種子進行除草劑抗性篩選;D.抗性植株PCR分子檢測。
　　2.利用正交實驗設計,對影響農桿菌轉化效率的主要因素進行優(yōu)化,同時分析這些因素對轉化后的玉米爛穗率以及結實率的影響,最終確定了玉米原位轉化體系的最佳轉化參數。結果表明,SilwetL-77是影響轉化效果最關鍵的因素,高濃度的Sil

3、wetL-77會降低結實率;其次是菌液濃度,且菌液濃度對玉米的爛穗率、結實率影響較大;高濃度的蔗糖會增加爛穗率。在菌液濃度為OD600=0.9,蔗糖濃度=30g/L,轉化介質中加入0.03(v/v)濃度的SilwetL-77時,PCR陽性率最高達到2.38％。
　　3.應用GUS基因瞬時表達技術對玉米原位轉化中農桿菌侵染途徑及位置進行組織化學分析,結果顯示:GUS基因表達最早見于子房組織,隨著侵染時間的持續(xù),連接子房與花序軸的小穗