高粱轉(zhuǎn)錄因子SbDREB2基因的克隆與功能分析.pdf

1、干旱、鹽堿、低溫等非生物逆境脅迫嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，極端惡劣條件下甚至導(dǎo)致植株死亡，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作物減產(chǎn)的重要因素。高等植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中為了抵抗這些逆境形成了許多復(fù)雜的防御機(jī)制。其中DREB類轉(zhuǎn)錄因子是一類植物中所特有的，能與DRE順式作用元件特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。該類轉(zhuǎn)錄因子在非生物逆境脅迫中能激活下游一系列抗逆功能基因的表達(dá)，并能提高脯氨酸和蔗糖含量。因此作物遺傳育種中利用DREB轉(zhuǎn)錄因子來(lái)改良作物的抗逆性，能獲得較為理想的

2、綜合效果。
　　 本研究以鹽處理的高粱幼苗為試驗(yàn)材料，通過(guò)電子克隆和RT-PCR技術(shù)，克隆高粱DREB轉(zhuǎn)錄因子基因cDNA序列;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)基因在不同逆境脅迫下表達(dá)模式進(jìn)行了研究;對(duì)基因進(jìn)行原核表達(dá)功能驗(yàn)證;并構(gòu)建了植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草。研究結(jié)果如下:
　　 1、根據(jù)GenBank電子拼接所得序列設(shè)計(jì)引物OF和OR，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到cDNA序列1152bp，ORF長(zhǎng)789bp，編碼蛋白含262個(gè)

3、氨基酸;利用上述引物擴(kuò)增基因組DNA，得到1個(gè)1892bp片段，測(cè)序分析表明該基因包含一個(gè)740bp的內(nèi)含子，將此基因命名為SbDREB2。預(yù)測(cè)蛋白分子量為28.64kD，等電點(diǎn)為5.52。氨基酸序列分析表明，該蛋白在82～145區(qū)含有DREB類轉(zhuǎn)錄因子家族特有的AP2保守結(jié)構(gòu)域，與玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白同源性分別為84％和69％。
　　 2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，該基因?yàn)榻M成型表達(dá)，在根、莖、葉中均存在表達(dá)

4、，根中表達(dá)量約是莖中2.5倍，受干旱、高鹽和外源ABA誘導(dǎo)強(qiáng)烈表達(dá)，但對(duì)低溫幾乎沒(méi)有響應(yīng)。
　　 3、設(shè)計(jì)含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物DF和DR，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切含有SbDREB2基因的T載體質(zhì)粒和pET28a原核表達(dá)載體質(zhì)粒，成功構(gòu)建重組子pET28a-SbDREB2，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得32.5kD左右的融合蛋白，與預(yù)期理論值相符。
　　 4、設(shè)計(jì)含有BglⅡ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物PF