多聚ADP-核糖聚合酶-1(PARP-1)及其相關信號通路參與豬卵泡發(fā)育及閉鎖的機制研究.pdf

1、對于哺乳動物，卵巢中僅有少數(shù)卵泡能夠發(fā)育至成熟排卵，絕大多數(shù)卵泡的命運是卵泡閉鎖(follicularatresia)。事實上，卵泡從早期發(fā)育直到排卵的整個過程都有卵泡閉鎖，普遍認為卵泡閉鎖對于維持卵巢環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義。然而，關于卵泡早期發(fā)育以及閉鎖的調控方面雖然已有很多報道，但仍存在許多不明之處。
　　為了研究豬卵母細胞巢的裂解、原始卵泡的形成和發(fā)育特征，我們根據(jù)本實驗室之前的研究結果，選取胎兒期90（日齡）、新生1日齡及

2、出生后25、70和150（日齡）5個階段豬的卵巢組織樣，應用蘇木素-伊紅染色(HE)方法進行組織學研究。結果表明，母豬在胚胎90日齡時卵巢中的生殖細胞主要以卵母細胞巢(oocytenest)結構存在，這時的卵母細胞巢正在裂解并形成原始卵泡;母豬在新生1日齡時卵巢中的生殖細胞主要以原始卵泡存在，這時在卵巢皮質部位仍見卵母細胞巢(oocytenest)結構存在，新生1天已經(jīng)有原始卵泡形成。根據(jù)HE結果統(tǒng)計出生前后各日齡階段卵母細胞巢和各級卵

3、泡的比例。總之，隨著豬日齡的增大，卵母細胞巢逐漸裂解并形成原始卵泡，在胚胎90日齡到新生1日齡是豬卵母細胞巢裂解和原始卵泡形成的關鍵時期，新生1日齡時豬卵巢中開始形成初級卵泡，說明原始卵泡的啟動募集在新生第一天已經(jīng)開始啟動，到25日齡、70日齡時隨著母豬日齡的增加卵母細胞巢逐漸較少，原始卵泡和初級卵泡逐漸增多，說明原始卵泡從新生1日齡左右到70日齡開始募集生長，這可為研究豬卵泡的啟動募集提供參考依據(jù)。
　　即便是在動物體內，細胞依

4、然能夠受到各種應激的影響，這種影響的最壞結果便是DNA鏈的損傷和斷裂。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內DNA損傷后相關蛋白會迅速會發(fā)生多聚ADP-核糖基化。多聚ADP-核糖基化是一種蛋白質翻譯后修飾作用，受多聚(ADP-核糖)聚合酶-1（PARP-1）調控，在DNA修復及細胞死亡等進程中起至關重要的作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)PARP-1參與多種生理與病理過程，但是它在卵泡發(fā)育及閉鎖過程中的作用仍未完全闡明。本研究旨在探討PARP-1，解離的PARP-1，ca

5、spase-3及解離的caspase-3在胎兒，新生兒和成年豬卵巢細胞中的表達模式和免疫定位。本次試驗研究表明，在胎兒豬和新生豬中，PARP-1解離參與卵母細胞巢破裂，原始卵泡形成以及轉變?yōu)槌跫壜雅?。免疫組化結果顯示PARP-1解離參與卵泡發(fā)育和閉鎖過程，這與我們之前的研究一致;然而，值得注意的是，解離的caspase-3主要定位于凋亡顆粒細胞的細胞核以及核周圍，而解離的PARP-1主要定位于凋亡顆粒細胞的細胞核中。放射免疫法(RIA)

6、的數(shù)據(jù)表明，出生后，血清中孕酮(P4)和雌二醇(E2)的濃度隨著年齡的增長而增加。綜上所述，本試驗的研究結果表明，PARP-1信號通路參與胎兒豬和新生豬卵巢中卵母細胞巢破裂和原始卵泡形成，但其機制與成年豬卵巢中細胞凋亡引發(fā)的卵泡閉鎖不同。有關PARP-1解離在豬卵泡中的作用仍需要進一步的研究。在畜牧生產或醫(yī)學上，雌性哺乳動物的卵泡在正常情況下或受到應激的情況下卵泡都可能走向閉鎖。卵巢卵泡閉鎖是脊椎動物的一種常見現(xiàn)象，卵泡閉鎖主要由顆粒細

7、胞凋亡所引起，但其具體機制仍不清楚。PARP-1是聚（ADP-核糖）聚合酶(PARP)家族的主要成員，盡管PARP-1的解離參與多種生理和病理過程，但其參與卵泡閉鎖的作用機制未見報道，我們從體內和體外兩個方面證實了PARP-1的解離參與了豬卵泡閉鎖的過程。本研究結合雌二醇(E2)、孕激素(P4)的濃度以及P4/E2(P/E)比值和卵泡形態(tài)特征來確定卵泡健康狀態(tài)，將卵泡分為將健康(H)，早期閉鎖(EA)和晚期閉鎖(PA)三個階段。免疫組織

8、化學(IHC)結果表明，解離的PARP-1主要定位于閉鎖卵泡凋亡顆粒細胞的核中;而PARP-1和caspase-3主要定位于健康卵泡(H)的顆粒細胞中;免疫印跡(WB)的結果表明，與健康卵泡(H)相比，閉鎖卵泡(EA、PA)中PARP-1的表達顯著下降，而解離的caspase-3(17kDa)表達量顯著增加，同時，與健康卵泡(H)相比，閉鎖卵泡(EA、PA)中解離的PARP-1(24kDa)顯著增加，這證實了caspase-3的活化參與

9、了卵泡閉鎖過程。為了進一步證實顆粒細胞凋亡在卵泡閉鎖過程中的作用，我們通過無血清培養(yǎng)建立了豬顆粒細胞凋亡模型。在凋亡的顆粒細胞中，PARP-1的表達顯著降低，而解離的PARP-1(24kDa)和解離的caspase-3(17kDa)顯著增加，這與體內研究結果具有一致性，同時表明caspase-3在缺少營養(yǎng)物質的條件下被激活?？傊?，激活的caspase-3導致PARP-1解離，且上述過程引起了顆粒細胞的凋亡;PARP-1可能通過其解離過程

10、參與調控豬卵泡的閉鎖，由caspase-3引起的PARP-1的解離可能是調控顆粒細胞凋亡及卵泡閉鎖的分子機制，因此，我們的發(fā)現(xiàn)有助于解釋和探究卵泡發(fā)育及閉鎖的調控機制，并可能為豬育種過程中提高母豬繁殖力及抗病育種提供有價值的線索和依據(jù)。
　　與PARP-1一樣，去乙?；窼irtuins也是NAD+依賴性酶，越來越多的研究顯示這兩種酶之間在發(fā)揮其各自的酶活性是對NAD+庫的利用存在著競爭，而細胞內的NAD+庫是有限的，因此在研究P

11、ARP-1作用時，有必要研究Sirtuins的變化。Sirtuins家族中的SIRT-1（TheSilentInformationRegulator1）和SIRT-2(TheSilentInformationRegulator2)是組蛋白去乙?；?HistoneDeacetylase，HDAC)第三類成員，屬于去乙酰化酶Sirtuins家族成員，廣泛存在于動物細胞中，在基因沉默、細胞周期調節(jié)、脂肪酸代謝等諸多細胞活動中發(fā)揮作用;研究發(fā)

12、現(xiàn)SIRT-1和SIRT-2在細胞凋亡中發(fā)揮重要的調控作用，然而對于他們在卵泡發(fā)育及閉鎖過程中的作用機制還不清楚。本研究旨在探討SIRT-1和SIRT-2在胎兒，新生兒和成年豬卵巢細胞中的表達模式和免疫化學定位。本試驗研究表明，在胎兒豬和新生豬中，SIRT-1和SIRT-2可能參與卵母細胞巢破裂和原始卵泡形成以及轉變?yōu)槌跫壜雅葸^程。免疫組化結果顯示SIRT-1和SIRT-2在卵泡發(fā)育和閉鎖過程中的表達與定位呈現(xiàn)一定的特征，這說明SIRT

13、-1和SIRT-2可能參與了卵泡發(fā)育及閉鎖過程。然而，有關SIRT-1和SIRT-2在卵母細胞巢裂解、原始卵泡形成和發(fā)育以及卵泡閉鎖過程中的作用機制尚待進一步的研究。
　　細胞內的許多蛋白能夠受到乙?；腿ヒ阴；揎?，從而改變相關蛋白的活性特征，上面已經(jīng)提到去乙?；窼irtuins，目前研究較多的乙?；搁]鎖是CBP/p300。CREB（CREBbindingprotein）結合蛋白CBP/p300共激活轉錄因子家族是由兩個密切

14、相關的轉錄共激活蛋白（或共激活因子）組成，廣泛存在于動物細胞中，在基因沉默、細胞周期調節(jié)、脂肪酸代謝等諸多細胞活動中發(fā)揮作用;研究發(fā)現(xiàn)CBP/p300在細胞凋亡中發(fā)揮重要的調控作用，然而對于它們在卵泡發(fā)育及閉鎖過程中的作用機制還不清楚。本研究旨在探討CBP/p300在胎兒，新生兒和成年豬卵巢細胞中的表達模式和免疫定位。本次試驗研究表明，在胎兒豬和新生豬中，CBP/p300可能參與卵母細胞巢破裂和原始卵泡形成以及轉變?yōu)槌跫壜雅葸^程。免疫組

15、化結果顯示CBP/p300在卵泡發(fā)育和閉鎖過程中的表達與定位呈現(xiàn)一定的特征，這說明CBP/p300可能參與了卵泡發(fā)育及閉鎖過程。然而，有關CBP/p300在卵母細胞巢裂解、原始卵泡形成和發(fā)育以及卵泡閉鎖過程中的作用機制尚待進一步的研究。
　　研究發(fā)現(xiàn)，乙酰化酶CBP/p300能夠對組蛋白H3(histoneH3)乙酰化修飾，而Sirtuins家族中的SIRT-1和SIRT-2都能夠對其進行去乙?；揎?值得注意的是，這兩種修飾之間

16、存在著動態(tài)平衡，組蛋白在乙酰基轉移酶(HATs)和去乙?；?HDACs)的作用下保持著動態(tài)平衡，研究證明組蛋白的乙酰化或去乙?；揎椖軌蛴绊懙饺旧|的轉錄活性狀態(tài)。一般來說，組蛋白的乙?；龠M轉錄，而去乙酰化則抑制轉錄。HistoneH3是在真核細胞中的染色質結構中的五個主要組蛋白之一。HistoneH3的修飾包括乙?；c去乙?；?，它們分別是由組蛋白乙酰轉移酶(HATs)和去乙?；D移酶(HDACs)所催化;已有的研究發(fā)現(xiàn)Histon

17、eH3在細胞凋亡中發(fā)揮重要的調控作用，然而對于他們在卵泡發(fā)育及閉鎖過程中的作用機制還不清楚。本研究旨在探討HistoneH3和乙?；腍istoneH3蛋白在胎兒，新生兒和成年豬卵巢細胞中的表達模式和免疫定位。本研究表明，在胎兒豬和新生豬中，HistoneH3的乙?；赡軈⑴c卵母細胞巢破裂和原始卵泡形成以及轉變?yōu)槌跫壜雅葸^程。免疫組化結果顯示HistoneH3和乙?；腍istoneH3在卵泡發(fā)育和閉鎖過程中的表達與定位各自呈現(xiàn)一定的特