棉鈴蟲和赤擬谷盜鈉離子通道基因的克隆與選擇性剪接分析.pdf

1、電壓門控鈉離子通道在細胞興奮性傳導過程中具有重要作用，也是DDT、擬除蟲菊酯和新型噁二嗪類殺蟲劑的主要作用靶標。目前，對昆蟲鈉離子通道與抗藥性關系的研究主要集中于昆蟲對擬除蟲菊酯的擊倒抗性。棉鈴蟲Helicoverpa armigera(Hübner)是一種重要的棉花害蟲，許多國家的棉鈴蟲都對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生了嚴重的抗性。赤擬谷盜Tribolium castaneum是鞘翅目重要儲糧害蟲，也是除黑腹果蠅Drosophila mel

2、anogaster、岡比亞按蚊Anopheles gambiae、家蠶Bombyx mori外第4個被全基因組測序的昆蟲。本文克隆了棉鈴蟲和赤擬谷盜鈉離子通道基因，并分析了其在不同發(fā)育階段的mRNA表達水平，比較了其基因組結構和選擇性剪接位點，研究結果對于進一步明確昆蟲鈉離子通道的結構和功能關系以及新型高效殺蟲劑的創(chuàng)制具有重要的理論意義和實踐價值。
　　通過RT-PCR技術克隆了棉鈴蟲和赤擬谷盜鈉離子通道基因全長cDNA序列，Ha

3、Nav和TcNav。HaNav開放閱讀框長6168bp，編碼2055個氨基酸殘基;TcNav開放閱讀框長6138bp，編碼2045個氨基酸殘基。HaNav和TcNav氨基酸序列的一致性為76％，HaNav、TcNav與黑腹果蠅鈉離子通道基因para氨基酸序列的一致性都為75％。HaNav和TcNav與已知昆蟲鈉離子通道具有共同的結構特征，包括4個典型的同源結構域(Ⅰ-Ⅳ)，每個結構域含6個跨膜片段(S1-S6)。決定離子選擇性的重要基序

4、DEKA（分別位于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ同源結構域S5和S6連接環(huán)）在HaNav(D385，E997，K1517，A1810)和TcNav(D387，E988，K1492，A1785)中高度保守，而在鈉離子通道快速失活中起著重要作用的位于同源結構域Ⅲ和Ⅳ之間的疏水性MFM基序也存在于HaNav(1584-1586)和TcNav（1559-1561）中。利用實時熒光定量PCR進一步對HaNav和TcNav的mRNA表達水平的分析發(fā)現，HaNav和

5、TcNav在棉鈴蟲和赤擬谷盜不同發(fā)育階段的表達水平存在一定差異。
　　基因組結構分析發(fā)現，HaNav和鱗翅目昆蟲煙芽夜蛾Heliothis virescens、小菜蛾Plutellaxylostella及家蠶鈉離子通道基因相似，含有33個外顯子。與HaNav相比，TcNav含有26個外顯孑，對應HaNav外顯子8-10，22-25，30-31，32-33分別合并為一個外顯子。HaNav和TcNav的外顯子序列一致性為43-87％。

6、盡管HaNav和TcNav的15個外顯子長度完全相同，但兩者內含子長度差異較大，HaNav的內含子平均長度是TcNav的4.7倍。除了TcNav第12內含子5'剪接位點為GC外，HaNav和TcNav內含子都具有保守的5'剪接位點GT和3'剪接位點AG。
　　對cDNA克隆的多重序列比對發(fā)現，HaNav和TcNav存在多個選擇性剪接位點。在HaNav中，對應著黑腹果蠅para選擇性剪接位點j、i和f，外顯子2，外顯子11的3'端和

7、外顯子21的5'端分別發(fā)生了外顯子跳躍、選擇性3'剪接和選擇性5'剪接，兩對互斥外顯子18a/b和26a/b分別與para的c/d和l/k相對應，對應para選擇性剪接位點a和b的外顯子12、16的5'端存在于所有克隆中，但e和h在HaNav中未發(fā)現。在TcNav中，對應著para選擇性剪接位點j和i，外顯子2，外顯子9的3'端分別發(fā)生了外顯子跳躍、選擇性3'剪接，對應para選擇性剪接位點a的外顯子10的5'端存在于所有克隆中，但e和