凡納濱對蝦血藍蛋白抗菌降解肽段的鑒定、抑菌活性分析及其相關降解酶的探索.pdf

1、對蝦養(yǎng)殖業(yè)目前已成為我國水產養(yǎng)殖中的支柱性產業(yè),但近年來因病害和生物安全等因素給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。鑒于此,學者們認為“以免疫防治為主,預防與治療相結合”的對蝦健康養(yǎng)殖方法,尤其是開發(fā)尋找替代抗生素的綠色抗菌肽,是解決目前對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展瓶頸的有效途徑之一。有趣的是,近年來研究發(fā)現存在于對蝦血淋巴中的血藍蛋白可以產生具有功能性的抗菌降解肽段,但迄今為止,其研究還不夠全面而深入。為此,本研究在此基礎之上,對凡納濱對蝦血藍蛋白降解肽段的種類

2、、抑菌活性及其相關降解酶等進行了較為系統(tǒng)而深入的研究,所獲主要研究結果如下:
　　1、對蝦血藍蛋白抗菌降解肽段的預測及其抑菌活性分析
　　采用AntiBPServer、CAMP、APD2等三個在線軟件預測凡納濱對蝦血藍蛋白產生抗菌降解肽的可能性。結果發(fā)現,血藍蛋白大小亞基有可能產生34個分子量范圍為1.5-1.9kDa的抗菌肽段,其中12個肽段由于可能會形成α螺旋結構,且能與病原菌膜相互作用,提示其具有抗菌肽的可能性最大。<

3、br>　　在此基礎之上,進一步采用多肽固相化學方法合成該12條可能性最大的抗菌肽段,并分析其抑菌活性。結果表明,所合成的12種血藍蛋白肽段對革蘭氏陰性菌(副溶血弧菌)和(或)革蘭氏陽性菌(乙型鏈球菌)表現出明顯的抑菌活性,與陰性對照相比,其抑菌活性大小均在90％以上,其中,S7、S9、B2、B13等四種肽段對副溶血弧菌和乙型鏈球菌均具有較強抑菌活性,S8、S10、B1、B3、B9、B10、B11、B14等八種肽段僅對副溶血弧菌具有抑菌活

4、性。由此說明,生物信息學結合抑菌實驗策略是研究血藍蛋白抗菌肽段的一種快速而有效的策略。
　　2、病原菌刺激后對蝦血藍蛋白抗菌降解肽段的分離、鑒定與抑菌活性分析
　　首先,采用Tricine-SDS-PAGE、Western-blotting、質譜等蛋白質組學方法,分析副溶血弧菌刺激對蝦后其血漿中產生血藍蛋白降解肽段的情況。結果發(fā)現,副溶血弧菌刺激對蝦24h后在其血漿中發(fā)現5個與抗血藍蛋白抗體呈明顯陽性的小分子肽段。
　

5、　繼而,選取分子量約為6.0kDa的①號降解肽段進行質譜分析,結果顯示,其與凡納濱對蝦血藍蛋白(gi|32546253和gi|854403)具有高度同源性。提示,這些小分子肽段應為血藍蛋白的降解肽段。
　　最后,采用平板菌落計數方法分析該①號降解肽段的抑菌活性。結果發(fā)現,其對副溶血弧菌具有明顯的抑菌活性(抑菌率約為98%),與陰性對照相比,具有極顯著性差異。
　　由此說明,病原菌刺激后對蝦血藍蛋白確實可以產生不同大小的抗菌肽

6、段。
　　3、與對蝦血藍蛋白抗菌降解肽段形成的相關蛋白酶探索
　　首先,采用ExPASy軟件預測可能參與血藍蛋白降解肽段形成的酶,結果發(fā)現,糜乳蛋白酶(Chymotrypsin)、蛋白酶K(ProteinaseK)、胰蛋白酶(Trypsin)、胃蛋白酶(Pepsin)、熱溶素(Thermolysin)以及內肽酶(Endopeptidase)等六種蛋白酶可能與血藍蛋白降解肽段的形成有關。
　　其次,采用Substrate

7、-SDS-PAGE酶譜技術探索對蝦肝胰腺粗酶液對血藍蛋白降解的影響,結果發(fā)現,粗酶液中的胰蛋白酶等其它蛋白水解酶可能與血藍蛋白的降解有關。
　　最后,運用體外胰蛋白酶酶解試驗、Tricine-SDS-PAGE以及Western-blotting等技術進一步分析胰蛋白酶對血藍蛋白的降解作用。結果表明,胰蛋白酶可將血藍蛋白降解成分子量約為5.0～20.0kDa的小分子肽段群,其中3個肽段與副溶血弧菌刺激后對蝦血藍蛋白產生的降解肽段分子