碩士論文——兩種鄰苯二甲酸酯物質的抗雄激素作用研究

1、<p>　　兩種鄰苯二甲酸酯物質的抗雄激素作用研究</p><p>　　摘 要：目的 探討鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）和鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）的抗雄激素作用。方法 參照OECD Hershberger試驗指南進行，以6周齡雄性去勢SD大鼠為試驗動物，隨機分為16組（7只/組），分別以DEHP和DBP為受試物，DEHP劑量分別為35、70、150、250、500、1000 mg/kg.b

2、w，DBP劑量分別為70、150、250、500、750、1000 mg/kg.bw；陰性對照組和陽性對照組分別灌胃給予玉米油和3.0mg/kg.bw氟他胺，連續(xù)10天。灌胃前各組均皮下注射丙酸睪酮。試驗結束后測定陰莖頭、腹側前列腺、精囊、肛提肌-海綿體肌、尿道球腺重量和血清中睪酮、黃體生成素水平。利用基準劑量分析軟件分析雄激素依賴組織器官重量的劑量-反應關系。結果 250、500、1000 mg/kg.bw DEHP劑量組腹側前列腺

3、、肛提肌-海綿體肌、尿道球腺重量低于陰性對照,差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），500、750、1000 mg/kg.bw DBP劑量組肛提肌-海綿體肌、尿道球腺重量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），各組間血清激素</p><p>　　關鍵詞：鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯；鄰苯二甲酸二丁酯；Hershberger試驗；抗雄激素；內分泌干擾；基準劑量；</p><p>

4、;　　Study for anti-androgenic effect of two of Phthalate esters</p><p>　　Abstract：Objective Study the anti-androgenic effect of diethylhexyl phthalate( DEHP ) and Dibutyl phthalate ( DBP ). Methods According

5、to Hershberger bioassay form OECD guideline, 6 weeks old male SD rats were randomly divided into 16 groups, DEHP( 35, 70, 150, 250, 500, 1000 mg/kg.bw) and DBP ( 70, 150, 250, 500, 750, 1000 mg/kg.bw ) were given by oral

6、 gavage, respectively. Meanwhile, coin oil was given by oral gavage as a negative control, and 3.0 mg/kg.bw flutamide was given by oral gavage as</p><p>　　Key words： Diethylhexyl phthalate; Dibutyl phthalate

7、; Hershberger Bioassay; Anti-androgenic; Endocrine-disrupting; Benchmark does</p><p>　　近年來，鄰苯二甲酸酯類物質（Phthalate esters，PAEs）的內分泌干擾作用逐漸成了國內外的研究熱點。在我國，鄰苯二甲酸二(2-乙基）己酯（diethylhexyl phthalate, DEHP）和鄰苯二甲酸二丁酯（Dibut

8、yl phthalate, DBP）的使用量占增塑劑的前兩位[]，在食品包裝材料、器皿、醫(yī)療用品、化妝品以及人造革等方面都被廣泛應用[-]。2012年和2013年發(fā)生臺灣塑化劑事件和大陸白酒檢出塑化劑事件，這兩種物質是主要檢出物質，其毒性和健康風險備受關注。</p><p>　　已有研究表明，DEHP、DBP具有不同程度的神經(jīng)毒性、生殖毒性、發(fā)育毒性、免疫毒性、胚胎毒性等毒效應[-]。也有研究資料提示該類物質可能

9、具有內分泌干擾作用[-]。目前對于DEHP和DBP在抗雄激素作用上的研究較少，缺乏抗雄激素作用準確的毒性參考閾值和劑量-反應關系。</p><p>　　本研究參照經(jīng)濟合作與發(fā)展組織試驗指南（OECD TG441）[]，通過Hershberger試驗研究DEHP和DBP的抗雄激素作用，利用基準劑量法分析其劑量-反應關系，并獲得基準劑量（Benchmark does, BMD）和基準劑量下限（Benchmark do

10、es lower bound, BMDL）。為探討DEHP和DBP的內分泌干擾效應及其聯(lián)合作用研究提供科學依據(jù)。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>　　1.1 試劑與儀器</p><p>　　DEHP、DBP、氟他胺（Flutamide, FT），均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；丙酸睪酮（Test

11、osterone Propionate, TP），購自北京冠星宇科技有限公司；金龍魚玉米胚芽油，購于豐益貿易（中國）私人有限公司；血清睪酮（Testosterone, T）、黃體生成素（Luteinizing Hormone, LH）放射免疫試劑盒，購于北京北方生物工程研究所；去大豆成分飼料，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。</p><p>　　低速高速離心機，購于北京東南儀誠實驗室設備有限公司；XH-608

12、0伽馬計數(shù)器，購于西安核儀廠；BiotekSynergy 4多功能酶標儀，購于基因有限公司；BS423S電子天平，購于賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。</p><p><b>　　1.2 實驗動物</b></p><p>　　SPF級6周齡Sprague Dawley（SD）雄性大鼠112只，體重190-210g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[生產(chǎn)許可證：

13、SCXK（京）2012-0009]，飼養(yǎng)于中國疾病預防控制中心動物實驗室[實驗動物許可證號：SYXK（京）2009-0032]。飼養(yǎng)條件：溫度為20-24℃、濕度為40-70%、動物照度15-20LX、換氣次數(shù)≥15次/h、12h晝夜交替、空氣清潔度7級、噪聲dB（A）≤60。</p><p><b>　　1.3 方法</b></p><p>　　1.3.1 動物

14、分組與處理</p><p>　　參照OECD TG441等[11-][]的方法，SD大鼠適應性喂養(yǎng)3天后，觀察無異常，用血管結扎的方法摘除睪丸和附睪。術后恢復1周，將大鼠按照體重隨機分為8組：1個陰性對照組、1個陽性對照組、6個劑量組。試驗分兩次完成，分別為關于DEHP和DBP的Hershberger試驗，將TP、FT、DEHP或者DBP用玉米油溶解為相應濃度的溶液，各組均皮下注射0.2mg/kg.bw的TP（皮

15、下注射量為0.5ml/kg），30min后，陰性對照（Solvent control, SC）灌胃（灌胃量為5ml/kg，下同）給予玉米油，陽性對照（Positive control, PC）灌胃給予3mg/kg.bw的FT，DEHP劑量組分別灌胃給予35、70、150、250、500、1000 mg/kg.bw的DEHP，DBP劑量組分別灌胃給予70、150、250、500、750、1000 mg/kg.bw的DBP。連續(xù)給樣品10d

16、，期間每隔24小時稱重且記錄，并以體重調整灌胃量。</p><p>　　1.3.2 器官稱量和血清睪酮、黃體生成素檢測</p><p>　　最后一次給樣品24h后稱量大鼠體重，并用2%戊巴比妥鈉麻醉。待大鼠進入麻醉狀態(tài)后，將其解剖，經(jīng)腹主動脈采血后，取5個雄激素依賴性組織器官：陰莖頭、腹側前列腺、精囊、肛提肌-海綿體肌、尿道球腺，以及肝臟、腎臟、腎上腺稱重（精確到0.001g）并記錄，計

17、算肝臟、腎臟、腎上腺的臟器系數(shù)，臟器系數(shù)公式為：</p><p>　　采用放免法檢測血清中睪酮（T）和黃體生成素（LH）含量，具體操作程序依照相應試劑盒說明規(guī)程進行。</p><p><b>　　1.4 數(shù)據(jù)分析</b></p><p>　　1.4.1 各組間均值比較</p><p>　　實驗結果以 表示，應用SPS

18、S 19.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時兩兩比較用LSD法，方差不齊時兩兩比較用Dunnett’sT3法，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。</p><p>　　1.4.2 相關性檢驗</p><p>　　應用SPSS 19.0軟件進行兩變量線性相關分析，檢驗水準α=0.05，P<0.05為通過顯著性檢驗。</p&g

19、t;<p>　　1.4.3 BMD法擬合數(shù)據(jù)</p><p>　　使用基準劑量軟件（Benchmark does software，BMDS）2.6.0中文版（國家食品安全風險評估中心）分析DEHP和DBP對雄激素依賴性組織器官重量的劑量-反應關系，根據(jù)指標性質，選擇合適模型。本實驗數(shù)據(jù)為連續(xù)型，可選模型為：指數(shù)模型、希爾模型、線性模型、多項式模型、冪模型。將指標參數(shù)納入模型進行檢驗，當劑量-反應

20、關系檢驗P1<0.1與擬合優(yōu)度檢驗P2>0.1同時滿足時接受該模型，如果多個模型被接受，根據(jù)赤池信息量準則（Akaike information criterion，AIC）選擇AIC最小的模型?；鶞史磻˙enchmark response，BMR）選擇10%，擬合推算相應的BMD和BMDL,即BMD10和BMDL10。</p><p><b>　　2 結果</b></

21、p><p>　　2.1 一般觀察和動物體重</p><p>　　大鼠去勢后恢復良好，活動和進食正常。各組在給樣品前、給樣品后體重以及各組大鼠增重差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表1。</p><p>　　表1 DEHP和DBP對大鼠體重的影響 ( )</p><p>　　Table 1 The influence of DE

22、HP and DBP on body weight change of rats</p><p>　　注：a表示與陰性對照組相比P<0.05。</p><p>　　2.2雄激素依賴性組織器官的重量及比較</p><p>　　由表2可見，與陰性對照相比，250、500、1000 mg/kg.bw DEHP劑量組的大鼠腹側前列腺、肛提肌-海綿體肌、尿道球腺重量，以

23、及1000mg/kg.bw DEHP劑量組的大鼠陰莖頭和精囊重量降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與陰性對照相比，500、750、1000mg/kg.bw DBP劑量組的大鼠肛提肌-海綿體肌、尿道球腺重量，以及750、1000mg/kg.bw DBP劑量組的大鼠腹側前列腺和精囊重量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。</p><p>　　表2 DEHP和DBP對大鼠雄激素依賴性組織器官重

24、量的影響( )</p><p>　　Table 2 The influence of DEHP and DBP on androgen-dependent tissues weights of rats</p><p>　　注：a表示與陰性對照組相比P<0.05。</p><p>　　2.3 其他臟器的臟器系數(shù)及比較</p><p>

25、;　　由表3可見，與陰性對照相比，150、250、500、1000mg/kg.bw DEHP劑量組肝臟系數(shù)，以及500、1000mg/kg.bw DEHP劑量組腎臟系數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中肝臟系數(shù)隨劑量的增加而增加，呈正相關關系（r=0.875，P<0.05）；與陰性對照相比，500、750、1000mg/kg.bw DBP劑量組肝臟系數(shù)，以及750、1000mg/kg.bw DBP劑量組的腎臟系數(shù)升

26、高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中肝臟系數(shù)隨劑量的增加而增加，表現(xiàn)出正相關關系（r=0.542，P<0.05）。</p><p>　　表3 DEHP和DBP對大鼠其他臟器的臟器系數(shù)影響( )</p><p>　　Table 3 The influence of DEHP and DBP on organ coefficient of rats</p>

27、<p>　　注：a表示與陰性對照組相比P<0.05。</p><p>　　2.4 血清T、LH的測定與比較</p><p>　　血清T、LH測定結果顯示，陰性對照組、陽性對照組與各受試物劑量組之間差異均無統(tǒng)計學意義。(結果略)</p><p>　　2.5 BMDS分析結果</p><p>　　BMD分析結果顯示，雄激素依賴

28、性組織器官的發(fā)育與DEHP、DBP均具有劑量-反應關系(P1<0.1)，相應的BMD10和BMDL10見表4。其中，肛提肌-海綿體肌、尿道球腺對DEHP和DBP的反應均最為敏感，劑量-反應關系分別見圖1至圖4。按照模型接受擬合優(yōu)度檢驗原則，DEHP選擇基于肛提肌-海綿體肌為終點的希爾模型模型，DBP選擇基于尿道球腺為終點的希爾模型模型，兩種物質的BMDL10分別為35.87 mg/kg.bw和261.78mg/kg.bw。<

29、/p><p>　　表4 DEHP、DBP導致不同終點的BMD和BMDL值</p><p>　　Table 4 DEHP, DBP result in BMD and BMDL values of different endpoints</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　Hershberg

30、er試驗通過給青春期雄性大鼠去勢，使大鼠體內內源性雄激素水平降到最低，減少內源性雄激素的個體差異。去勢后的大鼠經(jīng)過7d恢復后雄激素依賴性器官組織重量達到一致的基準水平，此時雄激素依賴性器官組織對雄激素的敏感性更強，當靶器官組織受到參照雄激素（TP）刺激后重量的增加會相對一致。Hershberger試驗是目前檢測抗雄激素的最有效的篩檢方法[]。本課題組的陽性物FT在Hershberger試驗中對大鼠的雄激素依賴性器官產(chǎn)生了明顯的抑制作用，

31、成功建立了檢測模型。</p><p>　　Hershberger試驗指出，如果劑量組中兩個或兩個以上的組織器官重量出現(xiàn)顯著減少時，可以認為實驗結果呈陽性，即受試物具有抗雄性作用。本研究發(fā)現(xiàn)DEHP和DBP可顯著影響肛提肌-海綿體肌、尿道球腺、腹側前列腺重量，說明兩種物質表現(xiàn)出抗雄激素作用。其他研究結果提示了這兩種物質抗雄激素作用的潛在機制，比如：DEHP（500mg/kg.bw）影響青春前期雄性大鼠精子的發(fā)生、分

32、化和成熟，血清T水平較對照降低[]；PAEs導致雄性成年小鼠睪丸重量減輕和生精小管的萎縮，并伴有精原細胞的凋亡[]；低劑量的DEHP導致大鼠前列腺質量減輕，高劑量的DEHP暴露導致睪丸的組織生理學改變[]。但體外受體結合試驗表明DEHP和DBP不能直接結合雄激素受體（Androgen Receptor,AR）[],也有研究表明DEHP、DBP是通過雄激素受體非依賴性機制誘導抗雄激素作用[]。由于Hershberger試驗模型大鼠無睪丸，

33、下丘腦-垂體-性腺軸無法通過反饋機制進行內分泌調節(jié)，因此推測DEHP和DBP可能通過干擾雄激素轉運或者改變受體水平進而影響組織對雄激素的反應能力。</p><p>　　Byung[]研究表明，DEHP的抗雄激素作用強于DBP，本研究也說明了這一點。本研究結果顯示，DEHP在劑量達到250mg/kg.bw時，對模型大鼠的腹側前列腺、肛提肌-海綿體肌、尿道球腺產(chǎn)生顯著抑制作用，并且存在劑量-反應關系；DBP劑量達到5

34、00mg/kg.bw時，對模型動物的肛提肌-海綿體肌、尿道球腺產(chǎn)生抑制作用，劑量上升到750mg/kg.bw時，腹側前列腺和精囊也產(chǎn)生抑制作用。從靶器官敏感度角度來看，肛提肌-海綿體肌、尿道球腺、腹側前列腺的反應較為敏感，精囊次之，陰莖頭反應最不敏感。早有研究表明肛提肌-海綿體肌的發(fā)育依賴于睪酮[],前列腺的發(fā)育依賴于雙氫睪酮[]，因此結合肛提肌-海綿體肌和前列腺兩個靶器官可以用于內分泌干擾作用機制的研究。</p><

35、;p>　　BMD法是目前毒理學領域確定化學物毒性參考值的最新方法，較傳統(tǒng)的化學物未觀察到有害作用劑量水平（no observed effect level, NOAEL）和觀察到有害作用最低水平（lowest observed adverse effect level, LOAEL）更科學[]。DEHP和DBP分別在250mg/kg.bw、500mg/kg.bw劑量組表現(xiàn)出了抗雄性作用，即DEHP和DBP的抗雄激素作用LOAEL值

36、分別為250和500mg/kg.bw,相應的NOAEL值分別為150mg/kg.bw和250mg/kg.bw。結合表4顯示結果，可知DEHP和DBP的抗雄激素作用的BMDL10分別為150.38和276.78mg/kg.bw，兩種物質的BMDL10通過希爾模型和指數(shù)模型擬合所得。得到的BMDL10在數(shù)值上與NOAEL相近，但BMD法充分利用了所有的劑量-反應資料并且通過BMDL10來說明數(shù)據(jù)的變異性及不確定性，因此結果更加可靠[]。&l

37、t;/p><p>　　另外，本實驗結果顯示，DEHP劑量為150mg/kg.bw及以上時，大鼠肝臟器系數(shù)顯著高于陰性對照，劑量為500mg/kg.bw及以上時，大鼠腎臟器系數(shù)也顯著高于陰性對照；DBP在劑量為500和750mg/kg.bw時也分別表現(xiàn)為肝和腎臟器系數(shù)增加。在多項研究[-]]中也表述了相似的結論，其作用機制有待進一步研究。</p><p>　　綜上所述，本研究中DEHP和DBP單