柑橘遺傳圖譜構(gòu)建及類胡蘿卜素代謝調(diào)控研究.pdf

1、類胡蘿卜素是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，它不僅能為植物提供五彩斑斕的顏色，同時(shí)還能參與光合作用和激素合成等重要的生物學(xué)過(guò)程。β-胡蘿卜素作為一種主要的類胡蘿卜素，是人體維生素A的重要來(lái)源。此外，它做為人體必要的健康保護(hù)物能降低某些癌癥和心血管疾病的發(fā)病率。因此，研究植物β-胡蘿卜素的代謝調(diào)控具有十分重要的作用。柑橘由于富含類胡蘿卜素而成為研究類胡蘿卜素代謝調(diào)控的良好材料。本實(shí)驗(yàn)利用β-胡蘿卜素含量差異顯著親本的雜交群體構(gòu)建了高密度遺傳圖

2、譜，同時(shí)我們還利用柚β-胡蘿卜素突變體材料和超量表達(dá)柑橘LCYb基因后大量積累β-胡蘿卜素的番茄材料對(duì)β-胡蘿卜素的代謝與調(diào)控進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下:
　　1.柑橘雜交群體的創(chuàng)建及高密度分子遺傳圖譜的構(gòu)建
　　1)利用高β-胡蘿卜素含量材料（黃肉琯溪蜜柚）作為母本，低β-胡蘿卜素含量材料（坪山柚）作為父本，構(gòu)建其F1代遺傳分離群體，總共得到了550株雜交后代。
　　2)利用RAD-seq技術(shù)對(duì)親本及其124個(gè)雜種后代

3、進(jìn)行了測(cè)序，根據(jù)親本SNP位點(diǎn)信息對(duì)子代得到的SNP分型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。進(jìn)而通過(guò)測(cè)序深度、盂德?tīng)栠z傳的卡方檢驗(yàn)及缺失率對(duì)這些SNP位點(diǎn)進(jìn)行過(guò)濾，最終得到了1，543個(gè)可用于構(gòu)建遺傳圖譜的可靠SNP位點(diǎn)。
　　3)為便于圖譜間的整合及比較，我們從前人柚遺傳圖譜中篩選到了20個(gè)可用于本遺傳圖譜構(gòu)建的SSR引物。用篩選出來(lái)的多態(tài)性引物對(duì)本實(shí)驗(yàn)中的雙親及F1代遺傳群體（124個(gè)單株）進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)其分離情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　4)根據(jù)擬測(cè)交作圖

4、原理，利用Joinmap4.0軟件對(duì)獲得的1，563個(gè)標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，并構(gòu)建柚遺傳連鎖圖譜。這些標(biāo)記位點(diǎn)被定位在9條連鎖群上，總遺傳圖距為976.58 cM，標(biāo)記間平均距離為0.62 cM。大部分標(biāo)記在連鎖群上均勻分布，9個(gè)連鎖群上的標(biāo)記數(shù)目為81-285個(gè)，連鎖群長(zhǎng)度為75.42-139.26 cM。
　　5)利用這些標(biāo)記在遺傳圖譜及甜橙基因組的位置信息進(jìn)行共線性分析，結(jié)果顯示:大部分的標(biāo)記在二者間具有良好的共線性，這不僅說(shuō)明

5、本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建圖譜質(zhì)量的可靠性，也從一程度上證實(shí)了柚與甜橙極高的相似度。
　　6)將本研究構(gòu)建的圖譜和其他研究者構(gòu)建的包含有20個(gè)共同SSR標(biāo)記位點(diǎn)的2張柚圖譜進(jìn)行比較分析。發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記不僅分群及相對(duì)位置一致，同時(shí)遺傳距離也極為接近，這更進(jìn)一步證明了本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的遺傳圖譜質(zhì)量可靠。這些共有的SSR標(biāo)記使得我們未來(lái)能夠進(jìn)行圖譜的整合，使本研究構(gòu)建的圖譜具有更加重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　2.琯溪蜜柚果皮橙色突變體性狀形成機(jī)理的初探

6、r>　　1)利用HPLC測(cè)定了成熟期琯溪蜜柚有色層橙色突變體果皮中類胡蘿卜素的組成與含量變化。結(jié)果表明:突變體果皮中呈橙色是β-胡蘿卜素的大量累積所致，其β-胡蘿卜素的含量比野生型增加了10.5倍，并且總類胡蘿卜素的含量也增加了7.9倍。
　　2)利用qRT-PCR測(cè)定了突變體(MT)及其野生型(WT)中類胡蘿卜素代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。結(jié)果表明:MT中上游基因PSY、 PDS和CCS及下游基因CCD1、BCH和NCED2的表達(dá)

7、量都顯著低于野生型。
　　3) RNA-seq分析結(jié)果顯示:與WT相比共有303個(gè)基因在MT果皮中存在顯著差異表達(dá)(padj＜0.05)，其中135個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，而168個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。Pathway分析顯示，MT果皮中碳代謝、氨基酸的生物合成和淀粉與蔗糖代謝發(fā)生了顯著變化。
　　4) GC-MS測(cè)定結(jié)果顯示:大多數(shù)可溶性糖和氨基酸的含量都發(fā)生了顯著變化。其中，MT大多數(shù)可溶性糖的含量都顯著降低，但卻大量積累了WT中幾乎檢

8、測(cè)不到的天冬酰胺。綜合分析我們認(rèn)為，MT果皮中β-胡蘿卜素及總類胡蘿卜素的增加，一方面是由于類胡蘿卜素代謝下游基因下調(diào)表達(dá)，另一方面是由于糖酵解加速產(chǎn)生的前體物質(zhì)增加而引起的。而上游合成基因的下調(diào)表達(dá)很有可能是由于類胡蘿卜素積累后的反饋調(diào)節(jié)作用所引起的。
　　5)為了尋找參與β-胡蘿卜素代謝調(diào)控的關(guān)鍵基因，我們對(duì)另外一對(duì)β-胡蘿卜素突變體材料（果肉橙色突變體）也進(jìn)行了RNA-seq分析，共鑒定到了200個(gè)基因差異表達(dá)，其中92個(gè)基

9、因上調(diào)表達(dá)，108個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。對(duì)這兩對(duì)突變體材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)綜合分析后，我們找到了10個(gè)共同差異基因，這些基因主要參與脂肪酸代謝和抗性反應(yīng)。
　　3.轉(zhuǎn)CsLCYb基因調(diào)控類胡蘿卜素代謝的研究
　　1)利用實(shí)驗(yàn)室前期創(chuàng)制的類胡蘿卜素轉(zhuǎn)基因番茄材料，通過(guò)PCR篩選得到單拷貝純系植株T217-1用于后續(xù)研究。篩選得到的T2代CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)仍然呈現(xiàn)與T0代相似的黃色表型，說(shuō)明該轉(zhuǎn)基因事件十分穩(wěn)定。
　　2)選

10、取CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄三個(gè)發(fā)育時(shí)期（綠熟期、破色期和成熟期）的果實(shí)及其野生型對(duì)照作為研究材料。HPLC分析結(jié)果表明:三個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中β-胡蘿卜素及總類胡蘿卜素的含量都顯著增加，而α-支路的總類胡蘿卜素含量都明顯減少;成熟期轉(zhuǎn)基因果實(shí)中α-胡蘿卜素的含量顯著增加，同時(shí)還檢測(cè)到了野生型中沒(méi)有生成的紫黃質(zhì)。對(duì)三個(gè)時(shí)期CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)質(zhì)體發(fā)育及形態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，其與野生型之間不存在明顯差異。
　　3)利用qRT-PCR測(cè)

11、定轉(zhuǎn)基因及野生型番茄果實(shí)三個(gè)時(shí)期類胡蘿卜素代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)。結(jié)果表明:在綠熟期，轉(zhuǎn)基因果實(shí)除了PDS和LCYe呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)外，其它基因均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá);在轉(zhuǎn)色期，轉(zhuǎn)基因果實(shí)上游所有基因均表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而下游基因LCYE、BCH和ZEP則呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá);在成熟期，轉(zhuǎn)基因番茄中除ZEP外的其它類胡蘿卜素合成基因均上調(diào)表達(dá)。三個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)基因果實(shí)中ZEP基因的表達(dá)都顯著低于野生型。
　　4)芯片分析結(jié)果顯示，與對(duì)照相比共有93個(gè)基因在Cs

12、LCYb超量表達(dá)番茄果實(shí)中顯著差異表達(dá)（FDR≤0.05，差異倍數(shù)≥2），其中30個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，63個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。GO分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因的生物學(xué)功能主要以結(jié)合、催化活性、水解酶活性和蛋白結(jié)合為主。進(jìn)一步利用KEGG對(duì)這些差異基因所參與的代謝途徑分析后發(fā)現(xiàn)，次生代謝的合成和降解、脂類代謝、淀粉和蔗糖代謝以及光呼吸等代謝途徑在CsLCYb超量表達(dá)的番茄果實(shí)中發(fā)生顯著變化。
　　5)根據(jù)類胡蘿卜素合成基因表達(dá)數(shù)據(jù)，我們利用LC-M