熒光定量PCR方法在土傳煙草青枯病生防研究中的應用.pdf

1、煙草青枯病是由茄科勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的細菌性土傳病害,是煙草生產(chǎn)上的毀滅性病害。由于常規(guī)防治方法存在種種弊端,根際細菌介導的生物防治正成為備受人們關注的一種有效方法。本實驗室篩選到一株拮抗效果較好的短短芽孢桿菌,經(jīng)二次發(fā)酵用于煙草青枯病的防治。并且運用文獻報道的引物,建立起10種微生物的熒光定量PCR擴增方法,為快速檢測根際微生物群落數(shù)量,探索病原菌和拮抗茵在煙草根際的互作效應,從而進一步了解生

2、物有機肥對土壤微生物群落結構的影響提供了可靠的方法.研究結果分述如下:
　　 (1)運用文獻報道引物分別對細菌、真菌、固氮茵、勞爾氏菌以及硝化細菌等10種微生物進行熒光定量PCR擴增,優(yōu)化反應條件,繪制標準曲線方程。擴增結果顯示建立的熒光定量PCR方法擴增效率達到90％-105%(R2＞0.99),符合定量檢測要求,引物特異性好,引物濃度適宜,沒有引物二聚體干擾,退火溫度適宜。
　　 (2)分別采用傳統(tǒng)的平板計數(shù)法與熒光

3、定量PCR法對土壤中已知濃度的勞爾氏茵進行檢測,以驗證熒光定量PCR方法的相對可靠性.試驗結果表明,熒光定量PCR檢測速度快,操作簡單,檢測結果比平板計數(shù)結果更接近理論值,且三次試驗的重復性比平板計數(shù)結果更好,說明熒光定量PCR法檢測土壤中微生物具有準確率高、可重復性好等優(yōu)點,可用于土壤微生物的快速檢測.
　　 (3)采用盆栽試驗的方法,檢驗生物有機肥對煙草青枯病的防治效果。試驗結果表明,施用生物有機肥顯著降低了抗病品種K326

4、和感病品種南江三號煙草青枯病的發(fā)病率,且還促進了煙草生長,生物量增加14%以上。
　　 (4)采用熒光定量PCR方法,研究了生物有機肥處理對盆栽煙草根際青枯病原菌及拮抗茵動態(tài)變化的影響.結果表明:只接種病原茵處理(RS)土壤中青枯病原菌的fliC基因拷貝數(shù)顯著高于先接種病原茵再施用生物有機肥處理(RS+B10)和先施用生物有機肥后接種病原菌處理(BIO+RS)土壤中fliC基因拷貝數(shù),且這種效應與生育期和品種無關.旺盛生長期前,

5、施用生物有機肥處理土壤中短小芽孢桿菌屬拮抗菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)也顯著高于RS處理,說明生物有機肥將大量拮抗茵帶入土壤并在根周定殖。
　　 (5)2010年在福泉青枯病嚴重的連作田塊上進行了"BIO"功能性微生物肥料的生防試驗的研究。大田移栽前施用"BIO"功能性微生物肥料,移栽后不同時期調查煙草青枯病的病情指數(shù),以驗證功能性肥料的生防效果。感病品種紅花大金元在收獲前發(fā)病率為100%,所有處理病情指數(shù)同對照相當,抗病品種