與小麥抗白粉病相關的Hv-S-TPK基因的物理定位及其轉基因小麥植株的FISH鑒定.pdf

1、小麥白粉?。˙lumeriagraminisf.sp.tritici）是世界上許多國家小麥生產中危害日趨嚴重的病害之一，鑒別新的抗白粉病基因并進行基因定位和克隆變得越來越重要。南京農業(yè)大學細胞遺傳所利用染色體工程技術獲得小麥-簇毛麥6V附加系、代換系，6VS/6AL易位系等遺傳材料，并將Pm21基因定位于簇毛麥6V染色體短臂FL值為0.45-0.58的區(qū)域;通過基因芯片技術，從簇毛麥6VS上克隆到一個與小麥白粉病抗性相關的絲氨酸/蘇氨酸

2、激酶基因（serine/threoninekinasegene，簡稱Hv-S/TPK），并獲得含有該基因的TAC克隆，將該基因導入普通小麥中并獲得超量表達的轉基因植株，表明Hv-S/TPK基因的超量表達能顯著提高轉化植株的白粉病抗性。本研究在此基礎上，以普通小麥-簇毛麥6V異染色體系、轉Hv-S/TPK基因小麥植株為材料，采用順序TAC-FISH和GISH、分子標記等方法，對Hv-S/TPK基因進行染色體物理定位，分析小麥-簇毛麥6VS

3、小片段易位系的易位類型以及白粉病抗性，對轉基因小麥后代植株中Hv-S/TPK基因的染色體分布及遺傳特性進行初步分析。
　　一、Hv-S/TPK基因的物理定位
　　TAC15是本實驗室利用Hv-S/TPK基因的特異引物篩選小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系基因組TAC文庫，獲得的陽性單克隆，并進一步獲得了全長為5160bp的亞克隆;對亞克隆的序列分析結果表明，Hv-S/TPK基因的外顯子序列與簇毛麥上已得到的Hv-S/TPK基因

4、的cDNA序列100％同源。本研究以TAC15克隆作探針，以普通小麥-簇毛麥6V附加系、6V代換系、6VS/6AL易位系及其衍生品種，以及6VS添加缺失系、小片段易位系為材料，采用順序TAC-FISH和GISH、分子標記技術，進行該基因的染色體定位。Hv-S/TPK基因?；苑肿訕擞汣1NAU15分析表明，在6V附加系、6V代換系，6VS/6AL易位系以及添加缺失系del6VS-1（FL值0.00-0.58）基因組DNA中，均能擴增出特

5、異性條帶;在6V添加缺失系del6VS-2（FL值0.00-0.45），小麥-簇毛麥6VS染色體小片段易位系HY158-5（含有FL值為0.70-1.00的6VS染色體片段）、HY86-1（含有FL值為0.00-0.45的6VS染色體片段），未擴增出特異性條帶。以6V附加系、6V代換系，6VS/6AL易位系為材料，以TAC15克隆和簇毛麥基因組DNA作探針分別進行FISH和順序GISH，Hv-S/TPK基因在這些異染色體系的簇毛麥6VS

6、上均檢測到1個位點，F(xiàn)L值為0.575士0.035。利用順序TAC-FISH和GISH方法，在抗白粉病的6V異染色體系中均檢測到Hv-S/TPK基因信號，在感白粉病6V異染色體系均沒有檢測到Hv-S/TPK基因信號。分子標記分析結果與FISH檢測結果相吻合。
　　二、小麥-簇毛麥6VS小片段易位系的分子細胞學分析
　　以NJ1-15、NJ4、YC24、YC72-2、YC80-4、YC85-4、YC127-5、YC133-4、

7、YC135-1、YC138-4、YC146-4、YC152-2、DP67等13個小片段易位系為材料，采用順序TAC-FISH、GISH，以及6VS上的分子標記，結合白粉病接種鑒定，對其進行綜合分析。TAC-FISH結果表明，這些小片段易位系均含有Hv-S/TPK基因，與該基因?；苑肿訕擞汣INAU15分析結果一致;同一染色體制片順序GISH表明，該基因位于簇毛麥6VS染色體片段上。白粉病人工接種鑒定表明，含有Hv-S/TPK基因的植株

8、均抗白粉病。這些結果進一步明確了Hv-S/TPK基因與小麥白粉病的抗性相關。
　　三、轉基因小麥植株Hv-S/TPK基因的FISH鑒定
　　PCR分析表明，在基因槍法介導的、不同世代的轉基因小麥陽性植株中，Hv-S/TPK基因已經整合到小麥基因組中。以這些陽性植株為供試材料、以含有Hv-S/TPK基因的質粒為探針，采用順序FISH方法對外源基因在有絲分裂中期染色體上的分布進行了分析。在T1代植株H5及其后代共10株供試的轉基