FSH和17β-雌二醇聯合作用調節(jié)睪丸支持細胞Skp2表達的機制.pdf

1、睪丸支持細胞(Sertoli cell，SC)是曲細精管上皮中一種非常重要的功能細胞，為生精細胞的分化成熟提供激素、脂類、維生素等多種營養(yǎng)物質；與生精細胞構成睪丸曲細精管的主要組織結構。SC的功能主要受下丘腦-垂體-性腺軸的內分泌調節(jié)，血睪屏障功能使生精細胞受到良好的保護。睪丸支持細胞能支持生精細胞的數量是有限的，因此睪丸支持細胞的數量在一定程度上決定了睪丸產生精子的數量。
　　 FSH在0-50ng/ml的濃度能以劑量依賴的方

2、式促進睪丸支持細胞增殖，但當FSH濃度過高時，FSH的促增殖作用有所下降；17β-雌二醇在培養(yǎng)條件下能促進未成熟的大鼠或仔豬支持細胞增殖，并且它們都與cAMP、ERK1/2信號通路有關，但FSH和17β-雌二醇聯合作用時如何調節(jié)培養(yǎng)條件下未成熟仔豬睪丸支持細胞中Skp2的表達并不清楚。因此，本研究以體外培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細胞為研究對象，通過添加各種信號通路的抑制劑，應用Western Blottingting和實時熒光定量PCR等方法，

3、檢測Skp2蛋白和mRNA在FSH和17β-雌二醇聯合調節(jié)支持細胞增殖中的的表達，以闡明FSH和雌激素聯合作用時通過何種信號通路調節(jié)Skp2的表達，為進一步認識睪丸支持細胞增殖的分子機制奠定基礎。
　　 本實驗以仔豬為研究對象，用FSH(50ng/ml)和17β-雌二醇(10-9mol/L)聯合處理支持細胞0min、15min、30min、60min、90min后，收集細胞提取蛋白和RNA，用Western blotting檢測

4、Skp2的表達量，用熒光定量PCR檢測Skp2 mRNA的表達。結果發(fā)現，FSH和17β-雌二醇共同作用促進了Skp2蛋白的表達，30min時，蛋白的量最大，此后Skp2蛋白的表達有所下降，到90min時，Skp2蛋白的表達量與對照相比無顯著差異；FSH和17β-雌二醇共同作用15min后，Skp2 mRNA的表達量增加了1.93倍(P<0.05)，到30min時，Skp2 mRNA的表達量最大，與對照相比，增加了7.39倍(P<0.0

5、5)，此后Skp2的表達有所下降，到90min時，Skp2 mRNA的表達量降為對照組的3.06倍(P<0.05)；實驗證明FSH和17β-雌二醇共同作用可以促進Skp2蛋白和mRNA的表達。
　　 進一步實驗研究了cAMP、PKA、Ca2+和ERK對FSH和17β-雌二醇聯合作用誘導Skp2表達的影響。加入cAMP的促進劑Forskolin促進了Skp2蛋白的表達，但其促進作用弱于FSH或17β-雌二醇的作用。分別加入環(huán)磷酸腺

6、苷抑制劑(Rp-cAMP)、蛋白激酶A(PKA)抑制劑(H-89)、L-Ca2+離子通道抑制劑(Verapamil)和ERK1/2抑制劑(U0126)時，它們都抑制了FSH和17β-雌二醇共同誘導的Skp2蛋白的表達；并且Forskolin明顯促進了Skp2 mRNA的表達，與對照相比增加了8.98倍(P<0.05)，但略低于FSH或17β-雌二醇的作用(P>0.05)。Rp-cAMP、H-89、Verapamil、U0126都影響了F

7、SH和17β-雌二醇共同作用時Skp2 mRNA的表達，Skp2 mRNA的表達水平與FSH和17β-雌二醇共同作用相比分別下降了50.66％、53.96％、51.46％、57.97％(P<0.05)。
　　 本實驗還分析了PKA、Ca2+對ERK1/2在支持細胞內活性的影響。結果發(fā)現，與對照相比，FSH和17β-雌二醇共同作用增強了ERK1/2的活性，但效果與FSH和17β-雌二醇單獨作用相比無明顯差異。H-89、Verapa