花生耐低溫種質(zhì)篩選及相關(guān)差異表達基因鑒定.pdf

1、花生是世界重要的油料作物和經(jīng)濟作物,特別在廣大發(fā)展中國家,是重要的食用植物油和食用蛋白源。溫度是影響花生生長發(fā)育,限制花生種植地理分布的重要因素之一。篩選耐低溫花生種質(zhì),并分離耐低溫相關(guān)基因?qū)τ谂嘤弋a(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的耐低溫型花生品種,進一步提高花生單產(chǎn),擴大花生種植面積,具有十分重要的意義。
　　 本研究首先利用55份花生種子進行低溫吸脹萌發(fā)試驗,統(tǒng)計露白率及芽長/種長,篩選耐低溫種質(zhì),并通過近紅外光譜技術(shù)測定油酸、亞油酸、棕櫚酸、脂肪

2、、蛋白質(zhì)及蔗糖含量,分析花生種子吸脹期間耐低溫性與各項品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性。結(jié)果表明:參試花生種質(zhì)在低溫脅迫條件下,露白率≥80％的種質(zhì)有3份、80％＞露白率≥70％的種質(zhì)有3份、70％＞露白率≥160％的種質(zhì)有5份、露白率＜60％的種質(zhì)有43份(占總數(shù)78.18％);芽長/種長＞0.5的種質(zhì)有3份、O.5＞芽長/種長＞0.4的種質(zhì)有5份、0.4＞芽長/種長＞0.3的種質(zhì)有3份、芽長/種長＜0.3的種質(zhì)有43份。其中,多粒型種質(zhì)A4的耐

3、低溫性最強,露白率為95％、芽長/種長為1.50。種子的露白率與芽長/種長呈極顯著正相關(guān)、與脂肪含量呈顯著正相關(guān),芽長/種長與亞油酸含量呈顯著正相關(guān)、與油酸含量呈顯著負相關(guān),但這兩項指標與百仁重相關(guān)性均不顯著。
　　 將耐低溫性最強的花生種質(zhì)A4,分別進行2℃吸脹處理和田間正常播種時的溫度15℃進行吸脹處理,取吸脹1h,6h和24h的花生樣品,提取花生種子的總RNA,并分離與純化mRNA,采用PCR-SelectTM cDNA

4、Subtraction Kit構(gòu)建3個低溫脅迫下的抑制差減雜交文庫(SSH cDNA文庫),分別標記為A庫、B庫和C庫。3個文庫分別隨機挑選500個克隆進行測序,成功測序的條數(shù)分別為336,429和466。經(jīng)序列組裝,A庫獲得8個unigenes,其中7個contig和1個singlet;B庫獲得18個unigenes,其中14個contig和4個singlet;C庫獲得193個unigenes,其中73個contig和120個sing

5、let。通過BLAST2GO軟件與GenBank中的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(non-redundant protein database)進行比對和功能注釋,其中,A庫7個unigene有相關(guān)同源信息,B庫14個unigene有相關(guān)同源信息,C庫132個unigene有相關(guān)同源信息?；蚬δ苤饕婕暗睫D(zhuǎn)錄調(diào)控、能量代謝、脅迫防御、細胞結(jié)構(gòu)、細胞保護、信號轉(zhuǎn)導和生物合成等方面。
　　 從3個文庫中獲得的重組克隆中,根據(jù)比對和注釋的結(jié)果,

6、挑選了14個感興趣的基因,驗證其在正常溫度處理下和低溫脅迫處理下,基因的差異表達情況。用熒光實時定量PCR的方法進行驗證,采用2-△△Ct的方法,每個反應重復3次取平均值。經(jīng)驗證,這14個基因在2℃低溫脅迫處理條件下的表達量是對照處理15℃情況下的2.85-12.85倍不等。
　　 選取4個經(jīng)驗證確實與植物耐低溫相關(guān)的基因,利用RACE的方法獲得全長序列,它們是LEA(胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白)基因、Oleosin(油質(zhì)蛋白)基因、

7、NAC轉(zhuǎn)錄因子以及MYB轉(zhuǎn)錄因子。其中,MYB基因是首次在花生上分離出來。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn),本實驗中所克隆LEA序列長度為1526bp,編碼155個氨基酸;Oleosin序列長度為760bp,編碼176個氨基酸;NAC序列長度為1406bp,編碼301個氨基酸;MYB序列長度為1365bp,編碼344個氨基酸。并用生物信息學軟件分別預測了其編碼蛋白的物理化學性質(zhì),功能結(jié)構(gòu)域,活性位點以及二級、三級結(jié)構(gòu)。這些工作為通過gene knock-