油菜抗逆相關(guān)基因的鑒定和功能分析.pdf

1、油菜是重要的油料作物,種子的含油量占其干重的35％-45％。菜油也是非常好的食用油,含有豐富的脂肪酸。菜油也是重要的工業(yè)原料,是我國發(fā)展生物柴油的理想的原料來源之一。因此大力發(fā)展油菜,提高油菜含油量,不僅能為我國能源安全戰(zhàn)略作出重要貢獻(xiàn),還將有助于保障我國的糧食安全,促進(jìn)農(nóng)民增收,具有十分重要的戰(zhàn)略意義。然而,油菜經(jīng)常受到高鹽、干旱、低溫和營養(yǎng)缺乏(如低磷、低鉀)等不良非生物脅迫的嚴(yán)重破壞,造成油菜產(chǎn)量嚴(yán)重下降。通過基因工程手段將一些具

2、有抗逆功能的基因?qū)胫参锘蚪M進(jìn)而獲得抗逆新品種,這為傳統(tǒng)育種模式的改革帶來了新的契機(jī)。
　　 與擬南芥、水稻等傳統(tǒng)模式植物相比,油菜中抗逆基因的鑒定和抗逆機(jī)制的研究還比較少。因此,篩選和鑒定油菜中與抗逆相關(guān)的基因,分析揭示其抗逆分子機(jī)制,可以為通過基因工程手段來改良油菜抗逆性提供了新的科學(xué)依據(jù)。本研究采用Maeroarray技術(shù),從油菜cDNA文庫中篩選了參與高鹽、干旱脅迫應(yīng)答的基因,并對一些感興趣的目標(biāo)基因進(jìn)行了深入的研究。

3、主要結(jié)果如下:
　　 1.通過Macroarray技術(shù)從油菜cDNA文庫中篩選鑒定參與高鹽、干旱脅迫應(yīng)答的基因
　　 采用Maeroarray技術(shù),從油菜cDNA文庫中共篩選得到313個(gè)參與鹽脅迫應(yīng)答的基因(172個(gè)受到高鹽脅迫的誘導(dǎo),141受到高鹽脅迫的抑制表達(dá)):477個(gè)參與干旱脅迫應(yīng)答的基因(288個(gè)受到干旱脅迫的誘導(dǎo),189個(gè)受到干旱脅迫的抑制表達(dá));154個(gè)基因受到高鹽和干旱兩種脅迫的雙重誘導(dǎo);104個(gè)基因受到

4、高鹽和干旱兩種脅迫的抑制表達(dá)。這也說明高鹽脅迫和干旱脅迫之間存在著共同的調(diào)控系統(tǒng)或信號交叉。
　　 2.高鹽干旱脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)模式分析
　　 從上述脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的候選基因中選取了13個(gè)基因做進(jìn)一步的研究。這些基因編碼的蛋白分屬于六個(gè)蛋白家族:蛋白激酶家族(MAPKKK和CIPK)、金屬硫蛋白家族、生長素應(yīng)答或抑制蛋白家族、脂類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、直接和脅迫相關(guān)的蛋白、代謝酶類。實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析了這13個(gè)基因在鹽脅迫、干

5、旱脅迫的表達(dá)模式,同時(shí)也分析了6個(gè)基因在ABA處理下的表達(dá)模式。結(jié)果如下:13個(gè)基因中,有7個(gè)基因的表達(dá)受到鹽脅迫的誘導(dǎo);12個(gè)基因的表達(dá)受到甘露醇(模擬干旱脅迫)的誘導(dǎo),其中包括6個(gè)受鹽脅迫誘導(dǎo)的基因;進(jìn)一步的研究揭示5個(gè)受干旱脅迫誘導(dǎo)的基因也受ABA的顯著誘導(dǎo)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明干旱和高鹽脅迫信號、干旱與ABA信號通路之間存在著交叉。組織表達(dá)分析結(jié)果顯示,這13個(gè)基因可能在油菜的不同組織器官發(fā)育中也發(fā)揮著重要的作用。
　　

6、3.冷調(diào)節(jié)基因BnCOR25的表達(dá)分析及功能鑒定
　　 我們從候選的288個(gè)干旱誘導(dǎo)的基因中,鑒定了一個(gè)新型的編碼冷調(diào)節(jié)蛋白的基因,該基因編碼蛋白的分子量為25KD,因此我們將其命名為BnCOR25(GeneBank號為HM187577)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示BnCOR25基因主要在下胚軸、子葉、莖和花中表達(dá),但是在根和葉子中表達(dá)量較低。Northern雜交證實(shí)BnCOR25基因的表達(dá)受到干旱和冷脅迫的顯著誘導(dǎo)。研究結(jié)果

7、還揭示BnCOR25基因的表達(dá)是受ABA信號通路調(diào)節(jié)的。BnCOR25蛋白主要定位于細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中。過量表達(dá)BnCOR25基因增強(qiáng)了裂殖酵母細(xì)胞在冷脅迫下的存活率;過量表達(dá)BnCOR25的轉(zhuǎn)基因擬南芥增強(qiáng)了對冷脅迫的耐受性。這些結(jié)果暗示該基因可能在賦予植物對冷脅迫耐受性中起一定的作用。
　　 4.BnCIPK6基因的表達(dá)鑒定和啟動(dòng)子活性分析
　　 在154個(gè)受干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)的候選基因中,其中有一個(gè)基因編碼的蛋白和

8、擬南芥CIPK蛋白激酶家族的成員CIPK6有很高的同源性,因而被命名為BnCIPK6。BnCIPK6基因的表達(dá)受到高鹽脅迫、滲透脅迫、低磷脅迫、ABA和BL的顯著誘導(dǎo)。組織表達(dá)分析結(jié)果顯示,BnCIPK6基因主要在花中表達(dá),在子葉中適度表達(dá),而在其它組織中表達(dá)水平較低。我們分離得到了約850bp長度的BnCIPK6啟動(dòng)子片段,組織化學(xué)染色分析揭示12天苗齡的擬南芥小苗,下胚軸和子葉中均有很強(qiáng)的GUS信號,而在其它組織中很弱或者檢測不到G

9、US信號;脅迫處理分析揭示BnCIPK6基因的啟動(dòng)子是受高鹽、滲透脅迫、ABA和BL誘導(dǎo)的。
　　 5.BnCIPK6互作蛋白的篩選及鑒定
　　 酵母雙雜交結(jié)果顯示BnCIPK6可以與擬南芥的CBL1,CBL2,CBL3和CBL9發(fā)生相互作用。將BnClPK6蛋白作為誘餌蛋白篩選油菜cDNA文庫,得到27種與其相互作用蛋白,這些互作蛋白涉及到植物生長發(fā)育、代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)方面。其中包括兩個(gè)CBL蛋白,分別與AtCBL

10、1和AtCBL3蛋白同源,我們將和AtCBL1同源性較高的油菜CBL蛋白,命名為BnCBL1,BiFC實(shí)驗(yàn)也證明了BnCIPK6和BnCBL1蛋白在體內(nèi)的相互作用。
　　 6.BnCIPK6和BnCBL1蛋白的亞細(xì)胞定位及BnCIPK6、BnCIPK6T182D蛋白的體外磷酸化分析
　　 亞細(xì)胞定位研究顯示BnCIPK6蛋白在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均有分布,而BnCBL1蛋白定位于細(xì)胞膜上。體外激酶磷酸化分析揭示點(diǎn)突變

11、的BnCIPK6T182D蛋白--BnCIPK6(M),相對BnCIPK6蛋白自磷酸化能力更強(qiáng),表明182位的蘇氨酸殘基是蛋白激活的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　 7.BnCIPK6、BnCIPK6(M)及BnCBL1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥均顯著增強(qiáng)了對鹽脅迫、低磷脅迫的耐受性
　　 為研究BnCIPK6及BnCBL1基因的功能,我們分別構(gòu)建了BnCIPK6、BnCIPK6(M)及BnCBL1過量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化了擬南芥,篩選獲得轉(zhuǎn)基因植

12、株。分別選取這些外源基因在擬南芥中表達(dá)量較高的純合株系做表型分析及功能研究。結(jié)果顯示BnCIPK6、BnCIPK6(M)及BnCBL1轉(zhuǎn)基因擬南芥均顯著增強(qiáng)了對鹽脅迫、低磷脅迫的耐受性。結(jié)果說明BnCBL1-BnCIPK6可能通過功能性的相互作用來參與植物對高鹽、低磷脅迫的應(yīng)答。
　　 8.BnCIPK6和BnCIPK6(M)坳的過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥增強(qiáng)了對ABA的敏感性
　　 我們分析了轉(zhuǎn)基因植株對ABA的應(yīng)答,結(jié)果顯

13、示BnCIPK6和BnCIPK6(M)的過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥均增強(qiáng)了對ABA的敏感性,尤其是后者顯示出了對ABA的超敏性。ABA相關(guān)的Marker基因包括RD29A,ABF3,ABF4在ABA處理后的BnCIPK6(M)的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量顯著升高。而我們并未觀察到過量表達(dá)BnCBL1的轉(zhuǎn)基因擬南芥對ABA應(yīng)答的改變。上述結(jié)果表明BnCIPK6參與了對ABA的應(yīng)答,而BnCBL1沒有參與AJ3A的應(yīng)答,暗示可能存在和BnCIPK6相

14、互作用的其它CBL蛋白,參與并介導(dǎo)了對ABA的應(yīng)答。
　　 9.BnCIPK6(M)的過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對BR應(yīng)答改變,且提高了對BR合成抑制劑BRZ的敏感性
　　 BnCIPK6(M)過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株改變了對油菜素內(nèi)酯(BR)的應(yīng)答,提高了對BRZ的敏感性。而我們并未觀察到BnCIPK6和BnCBL1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥對BR應(yīng)答表型的改變。這說明激活形式的BnCIPK6可能參與了BR的信號,同樣暗示可能存在和