豬霍亂沙門菌強(qiáng)毒株與弱毒株基因組和蛋白質(zhì)組差異分析.pdf

1、豬霍亂沙門菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Choleraesuis)是引起2～4月齡仔豬副傷寒的主要病原。仔豬副傷寒可一年四季發(fā)生，多與豬瘟混合感染，具有較高發(fā)病率與死亡率，可造成重大損失。豬霍亂沙門菌同樣對人類具有較高的致病性，常導(dǎo)致人發(fā)燒及敗血病等全身性感染癥狀。此外，當(dāng)前流行的豬霍亂沙門菌的多重耐藥性嚴(yán)重，對人類健康的潛在威脅很大，因此豬霍亂沙門菌的防控備受關(guān)注。
　

2、　 本研究利用抑制差減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了豬霍亂沙門菌強(qiáng)毒株與弱毒株的差減文庫，對差異序列進(jìn)行了初步分析。利用蛋白質(zhì)二維電泳技術(shù)(2-DE)以及實(shí)時熒光定量PCR分析了兩菌株間相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。
　　 1豬霍亂沙門菌強(qiáng)毒株與弱毒株抑制差減文庫的構(gòu)建及差異基因篩選
　　 利用抑制性差減雜交技術(shù)對豬霍亂沙門菌強(qiáng)毒株C78-2與弱毒株C500進(jìn)行基因組片段的差異分析，成功構(gòu)建了差減文庫。經(jīng)Dot-blot篩選后，對片段

3、進(jìn)行測序和同源性分析，結(jié)果在C78-2中發(fā)現(xiàn)了5個特異基因序列，分別為asr、ydgF、rpoS、ptsG和一個未知功能序列。同時，在C500株基因組中還發(fā)現(xiàn)大小為3290bp的DNA缺失區(qū)域，其內(nèi)包含asr、ydgD、ydgE、ydgF等4個基因。該差減文庫的建立為研究豬霍亂沙門菌弱毒株C500致弱機(jī)理提供了重要材料。
　　 2豬霍亂沙門菌強(qiáng)毒株與弱毒株比較蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究
　　 利用蛋白質(zhì)二維電泳技術(shù)對豬霍亂沙門菌

4、強(qiáng)毒株C78-2和弱毒株C500的菌體蛋白進(jìn)行了比較研究。將得到的電泳圖譜用PDQuest軟件分析后，選擇C78-2中特異的5個蛋白點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析，共有4個蛋白鑒定成功，成功率為80％。這些蛋白分別是CheY蛋白磷酸化酶CheZ、細(xì)菌鐵蛋白、OsmY蛋白以及核糖-5-磷酸異構(gòu)酶RptA。CheZ蛋白是CheY蛋白的磷酸化酶，是細(xì)菌趨化性的調(diào)節(jié)因子。細(xì)菌鐵蛋白是一種鐵儲存血紅素蛋白，與儲存機(jī)體中過剩的鐵，避免鐵離子造成的細(xì)胞毒性有關(guān)。O

5、smY蛋白是細(xì)菌的一種周質(zhì)蛋白，與細(xì)菌抵抗高滲透壓環(huán)境有關(guān)。核糖-5-磷酸異構(gòu)酶(RpiA)是一種磷酸戊糖途徑和卡爾文循環(huán)中必需的酶。這些研究結(jié)果為了解豬霍亂沙門菌遺傳進(jìn)化、致弱機(jī)理等提供了一定的理論基礎(chǔ)。
　　 3實(shí)時熒光定量PCR檢測豬霍亂沙門菌相關(guān)蛋白體外表達(dá)差異
　　 根據(jù)豬霍亂沙門菌強(qiáng)毒株C78-2和弱毒株C500基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)比較結(jié)果，共設(shè)計8個基因的檢測引物，包括rpoS、spvA，spvB、spvC、

6、bfr、cheZ、osmY，rpiA，同時設(shè)計了豬霍亂沙門菌gmk的引物作為內(nèi)參。提取兩株豬霍亂沙門菌體外液體LB培養(yǎng)的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNAs，利用熒光定量PCR比較各基因在體外培養(yǎng)時mRNA的表達(dá)水平差異。結(jié)果表明：rpoS在C500中不表達(dá)，從而進(jìn)一步證明了C500中rpoS的缺失。研究還發(fā)現(xiàn)，rpoS調(diào)控的spvA、spvB、spvC、osmY以及bfr、cheZ、rpiA在C78-2中的表達(dá)量顯著高于C500，與預(yù)期結(jié)果相