豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白重組抗原及單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、PRRSV是引起豬繁殖與呼吸障礙綜合征的主要病原,其分為兩個(gè)血清型:美洲型和歐洲型。美洲型自1995年底以來(lái)一直在中國(guó)內(nèi)陸流行,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大損失。2011年田克恭等報(bào)道在中國(guó)大陸首次發(fā)現(xiàn)歐洲型PRRSV。如何對(duì)PRRSV及時(shí)有效的鑒定,是減少經(jīng)濟(jì)損失,保護(hù)畜牧業(yè)健康有序發(fā)展的前提。由于單克隆抗體較高的靈敏性和特異性,以及其相關(guān)操作簡(jiǎn)單、廉價(jià)等特點(diǎn),所以利用單克隆抗體的診斷方法在疾病的檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用。本課題開(kāi)展了能夠同時(shí)識(shí)別

2、美洲型和歐洲型PRRSV的雜交瘤細(xì)胞株的制備及鑒定,為后續(xù)檢測(cè)試劑盒的研發(fā)做好鋪墊。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室保存的美洲型PRRSV HPBEDV毒株成功克隆出ORF7基因,并將其成功連接到原核表達(dá)載體pET-30a(+)上,轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)?？扇苄苑治霰砻髟吮磉_(dá)的融合蛋白是以包涵體的形式存在,復(fù)性后western boltting檢測(cè)證明其具有較好的抗原性。利用Ni2+-NTA樹(shù)脂親和層析純化后的融合蛋白

3、經(jīng)三次免疫和一次加強(qiáng)免疫Balb／c小鼠后進(jìn)行融合,經(jīng)過(guò)四次亞克隆和間接ELISA的篩選,最終獲得了兩株單抗(NA N002和NA N008)。間接ELISA檢測(cè)證明2株雜交瘤細(xì)胞所分泌的McAb特異性良好,并具有較高的穩(wěn)定性?？贵w亞型均為1gG2b。雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為100和105,腹水純化后只有抗體的重鏈和輕鏈兩條鏈,大小分別為50ku和25ku?？贵w效價(jià):NA N002為1:40960,NA N008為1:20480。特異性