杜氏鹽藻PEPC基因的克隆與油菜DGAT基因微藻表達載體的構建.pdf

1、杜氏鹽藻(Dunaliella salina)是一種抗逆性強的單細胞真核綠藻,能在高達5 M的鹽溶液中生長、繁殖。杜氏鹽藻最突出的優(yōu)點在于光合自養(yǎng)生長、培養(yǎng)條件簡單、抗逆性極佳,可以有效地通過大規(guī)模開放式培養(yǎng)獲得大量藻體,能極大地降低培養(yǎng)成本,因此適合作為高油脂工程藻株的候選藻種。在油脂代謝過程中有多種酶參與,并且對油脂合成產生重要的調節(jié)作用,而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和二酰甘油?；D移酶正是油脂代謝通路中非常重要的關鍵酶。磷酸烯醇式丙酮

2、酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)對油脂合成起到負調控作用,通過催化磷酸烯醇式丙酮酸不可逆反應生成草酰乙酸和磷酸,從而使磷酸烯醇式丙酮酸進入蛋白質合成代謝。因此磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶可以通過控制蛋白質和油脂合成的共同底物磷酸烯醇式丙酮酸的流向,從而決定了蛋白質/油脂含量比例。二酰甘油酰基轉移酶(diacylglycerolacyltransferase,DGAT)對油脂合成代謝起到正調控

3、作用,是催化三酰甘油生物合成的最后一步關鍵酶,在動植物中廣泛存在。DGAT1和DGAT2在細胞合成三酰甘油過程中的作用類似,DGAT1在三酰甘油代謝中具有廣泛的作用,而DGAT2更傾向于特殊脂肪酸的積累,兩者均能執(zhí)行三酰甘油生物合成的最后一步。
　　 目的:為了研究杜氏鹽藻PEPC基因的功能,克隆了杜氏鹽藻PEPC基因的cDNA全長序列;并且為了研究外源DGAT基因對微藻油脂代謝是否有影響,構建了SV40啟動子驅動目的基因DGA

4、T1和DGAT2進行表達的微藻真核表達載體并轉化了杜氏鹽藻。
　　 方法:根據(jù)NCBI上GenBank中公布的萊茵衣藻、擬南芥、花生等真核生物PEPC基因兩段高度保守的cDNA序列來設計杜氏鹽藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的簡并引物,通過RT-PCR的方法來獲得杜氏鹽藻PEPC基因的部分cDNA片段,并利用RACE技術首次從杜氏鹽藻中克隆了包含PEPC基因完整編碼區(qū)的cDNA序列。并且通過NCBI上GenBank中已公布的甘藍型油菜D

5、GAT1(登錄號AF164434)和DGAT2(AF155224)的序列設計引物,采用RT-PCR從甘藍型油菜中擴得DGAT1和DGAT2兩個基因cDNA編碼區(qū)序列,并構建SV40啟動子驅動目的基因DGAT1和DGAT2進行表達的微藻真核表達載體,通過基因槍轉化杜氏鹽藻,使用草丁膦對轉基因杜氏鹽藻進行篩選。
　　 結果:RT-PCR的方法來獲得杜氏鹽藻PEPC基因的部分cDNA片段,并利用RACE技術首次從杜氏鹽藻中克隆了包含P

6、EPC基因完整編碼區(qū)的cDNA序列。杜氏鹽藻的PEPC基因cDNA序列全長為3523 bp,包括完整的開放閱讀框2949 bp,編碼982個氨基酸,其蛋白質的相對分子質量為110560.5。并且克隆了甘藍型油菜DGAT1和DGAT2基因的cDNA完整編碼區(qū)序列,序列長度分別為1512 bp和1026 bp。構建了SV40啟動子驅動目的基因DGAT1和DGAT2進行表達的微藻真核表達載體pSV40DGAT1(2)/CaMVBar,通過基因