烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯病毒和類病毒的分子鑒定及檢測技術研究.pdf

1、烏魯木齊地區(qū)是新疆馬鈴薯種薯、商品薯的重要生產基地。當前馬鈴薯生產中病毒病發(fā)生普遍而嚴重，成為制約生產的主要障礙。優(yōu)質脫毒種薯是馬鈴薯產業(yè)健康、高效發(fā)展的重要保障，而建立快速、靈敏、準確的馬鈴薯病毒檢測技術是脫毒種薯生產的關鍵。本研究調查鑒定烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯病毒種類，研究建立重要病原病毒和類病毒的分子生物學檢測技術，為馬鈴薯無病毒原種材料的篩選和培育，種薯調運的檢疫檢驗，實施病毒病害有效的防治措施提供科學基礎和技術保障。
　　

2、 通過癥狀調查、電鏡觀察、RT-PCR擴增及其克隆、序列分析，鑒定明確了侵染烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯的主要病原病毒有PVX、PVY、PVA、PLRV，類病毒為PSTVd。其中PVY、PLRV的侵染率最高，其次為PVX、PVA，PSTVd的侵染率較低。同源性分析表明，PVY分離物中5個為PVYO株系，1個為PVYN株系；PSTVd烏魯木齊分離物同美國Wisconsin弱系的同源性為98.4%，同法國X76844中間株系M（mild）的同源性98

3、.8%。烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯主要病原病毒分離物核苷酸序列之間絕大多數高度同源，而與有些國內外其他地區(qū)分離物則存在較大差異。
　　 針對烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯的主要病原病毒PVX、PVY、PVA、PLRV，設計病毒外殼蛋白基因特異性引物對，建立了能夠同步檢測4種病毒一步法多重RT-PCR檢測方法。該法對PVX、PVY、PVA、PLRV擴增出的靶帶大小分別為732bp、422bp、132bp和336bp。病毒RNA最低檢測限度為7.8pg

4、/μL。對PVM、PVS、AMV、TMV及PSTVd的擴增為陰性。研究結果表明，該方法比兩步法多重RT-PCR檢測更加快速、簡便、高效。
　　 本研究根據PVA和PVY分離物CP基因的保守序列，分別設計了兩對特異性引物和兩條用不同熒光基團標記的TaqMan探針。對反應條件和試劑濃度進行優(yōu)化，建立了能夠同步檢測PVA和PVY的二重熒光定量PCR方法。檢測敏感度達到0.51fg/mL，比常規(guī)RT-PCR高100倍以上。