鴨圓環(huán)病毒cap基因的表達與檢測CAP抗體的間接ELISA方法建立.pdf

1、鴨圓環(huán)病毒（duck circovirus，DuCV）是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員之一，主要引起宿主的淋巴系統(tǒng)損傷，導致免疫抑制，進而引起繼發(fā)感染或二重及多重感染，已引起越來越多的關注。美國、匈牙利、德國和中國臺灣等地區(qū)相繼報道在番鴨、半番鴨、櫻桃谷肉鴨中發(fā)現(xiàn)該病毒。國內福建、山東、浙江和廣州等省份的流行病學調查，也證實了DuCV的普遍存在。
　　 DuCVcap蛋白是DuCV的主要的免疫原性蛋白，也是病毒的主要結構蛋白。為了能

2、夠得到DuCV的免疫原性蛋白，并以此建立診斷方法，為鴨場大規(guī)模樣品中檢測DuCV抗體提供依據(jù)。研究用DuCVcap基因原核表達蛋白，并進行純化，建立間接ELISA方法，初步應用于安徽省部分鴨場DuCV抗體檢測。具體如下：
　　 首先利用軟件對DuCVAQ0901株cap基因的保守區(qū)域進行分析，設計了一條特異性引物，將N末端影響外源蛋白表達的稀有密碼子截去后，將其克隆到原核表達載體PET-28a中，并在完成對構建質粒PCR、Eco

3、R/ⅠSalⅠ雙酶切鑒定，測序鑒定后，用誘導劑IPTG對其進行誘導表達，同時對誘導劑濃度，誘導時間，蛋白表達的可溶性等條件進行優(yōu)化。在大量表達重組dcap蛋白后，利用NI純化樹脂對His-dcap蛋白進行純化，同時還對重組蛋白的濃度，純度以及免疫活性等特性進行檢測，并用純化好蛋白免疫健康櫻桃谷肉鴨，制備了多克隆抗體血清。結果顯示，構建好的pET-28a-dcap重組質粒誘導表達后，經(jīng)SDS-PAGE檢測及Western-blot分析證明

4、，在大腸桿菌中得到了高效表達，并以包涵體的形式表達；用NI純化樹脂對His-dcap蛋白進行純化后，蛋白濃度可達1.285mg/mL，且表達蛋白保留了部分天然cap蛋白的抗原性；利用純化蛋白乳化后制備多克隆抗體血清經(jīng)瓊擴試驗測定抗體效價可達1∶128。
　　 其次利用上述純化好dcap蛋白建立一種檢測cap抗體的間接ELISA方法，為規(guī)?；唸鯠uCV感染情況調查提供快速簡易的血清學方法。即利用純化好的蛋白(dcap)作為包被抗

5、原，制備cap抗體陰陽性血清，用矩陣法篩選最佳工作濃度，同時也對抗原包被時間、一抗孵育時間、二抗反應時間、底物顯色時間等條件優(yōu)化確定，計算出陰陽性血清臨界值及結果判定方法。并用此方法對安徽省部分鴨場采集血清進行了DuCV抗體檢測。用純化cap蛋白包被酶標板，建立特異性檢測cap抗體的間接ELISA方法。確定該方法蛋白最佳包被量為6.57 μg/mL，血清最佳稀釋度為l∶80，陰陽性臨界值為0.391?？乖罴寻粫r間為4℃過夜，一抗孵育

6、、二抗反應、底物顯色最佳時間分別為1h，1h，15min。并用建立的間接ELISA方法，對安徽部分地區(qū)收集的338份鴨血清樣品進行cap抗體檢測，結果檢出陽性率為26.9％，證明了安徽部分地區(qū)鴨場中DuCV的感染普遍存在。用生物統(tǒng)計學方法對結果進行分析，顯示安徽省部分地區(qū)鴨群中以櫻桃谷肉鴨的DuCV感染率較高；不同日齡段的鴨群中DuCV的感染情況，以30-60日齡段高于其它日齡段；不同地區(qū)間DuCV陽性檢出率也存在著一定程度的差異。