小菜蛾GABA受體基因克隆及棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶的功能表達(dá).pdf

1、該博士論文為本人碩博連讀期間所傲內(nèi)容，總體分為兩部分，其中“小菜蛾GABA受體基因克隆”部分的內(nèi)容主要在碩士階段完成，“棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶的功能表達(dá)”部分的內(nèi)容由國(guó)家留學(xué)基金委聯(lián)合培養(yǎng)博士生項(xiàng)目資助在澳大利亞CSIRO昆蟲(chóng)所完成．
　　 1．小菜蛾GABA受體基因cDNA全長(zhǎng)的克隆及序列分析
　　 采用RT-PCR和RACE技術(shù)從小菜蛾中克隆得到GABA受體兩個(gè)亞基基因，即PxGABARal和PxGABARa2．PxGABA

2、Ral的cDNA編碼區(qū)長(zhǎng)1458bp，編碼485個(gè)氨基酸；PxGABARa2的cDNA編碼區(qū)長(zhǎng)1563bp，編碼520個(gè)氨基酸。兩個(gè)亞基均含有保守的四個(gè)跨膜區(qū)及半胱氨酸橋。黑腹果蠅Rdl基因直系同源A302S突變位點(diǎn)處，PxGABARal為A282，PxGABARa2為S285。分別對(duì)兩亞基的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性搜索，發(fā)現(xiàn)PxGABARal與其它GABA受體a亞基顯示了較高的相似性：煙芽夜蛾a3亞基(AF00

3、6192，95％)，煙芽夜蛾的a2亞基(AJ224513，85%)、黑腹果蠅Rdl亞基(AAF50311，84%)、小菜蛾a2亞基(FJ665610，83%)、家蠶a亞基(EF521821，81%)。PxGABARa2與其它GABA受體a亞基一致性為：煙芽夜蛾a2亞基(AJ224513，91%)、甜菜夜蛾a2亞基(ABQ45398，87%)、家蠶a亞基(EF521821，84%)、煙芽夜蛾的a3亞基(AF006192，83%)，黑腹果蠅

4、Rdl亞基（AAF50311，77%）。兩亞基在第三外顯子都存在兩種可變剪接形式，在第六外顯子均為同一種剪接形式。
　　 2．小菜蛾GABA受體亞基基因組結(jié)構(gòu)及其基因定位
　　 在已知小菜蛾P(guān)xGABARal和PxGABARa2基因cDNA序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物，利用染色體步移及常規(guī)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到小菜蛾P(guān)xGABARal和PxGABARa2除第一內(nèi)含子外的基因組序列，兩基因均包含9個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子一外顯子邊界符合GT-

5、AG規(guī)則，內(nèi)含子插入位點(diǎn)相同，且內(nèi)含子相高度一致，表明這兩個(gè)基因可能起源于近期的基因復(fù)制事件。為了確定兩個(gè)基因是否位于Z染色體上，分別采用兩種分子標(biāo)記對(duì)SZ-Diel品系雌性（ZSerW）和ROTH品系雄性小菜蛾(ZAlaZAla)單對(duì)雜交F1代進(jìn)行了基因型檢測(cè)。對(duì)于PxGABARa1，66個(gè)雜交F1代個(gè)體中，33個(gè)雌性個(gè)體為A282半合子，33個(gè)雄性個(gè)體為A/S282雜合子，這表明PxGABARa1位于Z染色體；對(duì)于小菜蛾P(guān)xGABA

6、Ra2，34個(gè)雜交F1代個(gè)體中，15個(gè)雌性個(gè)體均只有一條長(zhǎng)的條帶，與父本(ROTH)一致；19個(gè)雄性個(gè)體均同時(shí)有長(zhǎng)、短兩條條帶，一個(gè)來(lái)自父本(ROTH)另外一個(gè)來(lái)自母本(SZ-Diel)，證明了小菜蛾P(guān)xGABARa2基因也位于Z染色體上。
　　 3．小菜蛾P(guān)xGABARa1亞基A282S突變與狄氏劑及氟蟲(chóng)腈抗性關(guān)系
　　 為了明確小菜蛾P(guān)xGABARa1亞基A282S在狄氏劑及氟蟲(chóng)腈抗性中的作用，通過(guò)單對(duì)雜交分別建立了

7、含有A282S突變純合子的氟蟲(chóng)腈抗性品系SZ-FSer及狄氏劑抗性品系SZ-DielSer，并建立小菜蛾氟蟲(chóng)腈抗性近等基因系SZ-FAla。SZ-FSer相對(duì)與洛桑敏感品系ROTH和深圳對(duì)照品系SZ，對(duì)氟蟲(chóng)腈抗性倍數(shù)分別為208.43和182.75倍；對(duì)狄氏劑、硫丹、林丹有低水平的交互抗性，抗性倍數(shù)分別為6.4、1.89和5.81，對(duì)阿維菌素和多殺菌素沒(méi)有交互抗性。SZ-DielSer相對(duì)于洛桑敏感品系ROTH和深圳對(duì)照品系SZ對(duì)狄氏劑

8、分別有9.3和6.52倍的抗性；對(duì)氟蟲(chóng)腈、硫丹、林丹有低水平的交互抗性，抗性倍數(shù)分別為10.91、6.07和8.95，對(duì)阿維菌素及多殺菌素沒(méi)有交互抗性。SZ-FAla相對(duì)于洛桑敏感品系ROTH和深圳對(duì)照品系SZ對(duì)氟蟲(chóng)腈的抗性分別為101.20和88.73倍，對(duì)狄氏劑和硫丹不存在交互抗性。
　　 SZ-Fser、SZ-DielSer及SZ-FAla品系相對(duì)于SZ品系對(duì)狄氏劑的抗性倍數(shù)分別為6.4、6.52和1.34; SZ-FSe

9、r、SZ-DielSer相對(duì)于SZ-FAla品系對(duì)狄氏劑的抗性分別為4.77、4.86倍；SZ-FSer品系相對(duì)于SZ-FAla品系對(duì)氟蟲(chóng)腈的抗性倍數(shù)為2.06，從而表明小菜蛾P(guān)xGABARa1基因A282S突變是小菜蛾狄氏劑抗性的主要因子，是小菜氟蟲(chóng)腈抗性的次要因子。
　　 鑒定了SZ-DielSer品系與敏感品系ROTH正反交F1代不同藥劑處理后存活個(gè)體雌、雄蟲(chóng)的基因型，正交F1代雄蟲(chóng)（ZSerZAla）、雌蟲(chóng)（ZAlaW）

10、及反交F1代雄蟲(chóng)（ZSerZla）、雌蟲(chóng)(ZSerW)的存活比例如下：1.5ppm氟蟲(chóng)腈處理后分別為8.5%、6.5%和9%、10.1%；600ppm狄氏劑處理后分別為6.5%、全部死亡和5%、16.5%；1，500ppm硫丹處理后分別為11%、2.5%和13.5%、15.5%。該結(jié)果進(jìn)一步證明了小菜蛾P(guān)xGABARa1基因A282S突變是狄氏劑抗性的主要因子，是氟蟲(chóng)腈、硫丹抗性的次要因子，同時(shí)也證明小菜蛾狄氏劑抗性與Z染色體連鎖。

11、r>　　 4．棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的異源表達(dá)
　　 利用Gateway技術(shù)將棉鈴蟲(chóng)YG和YGF品系的羧酸酯酶CCE001a、CCE001c、CCE001d、CCE001i、CCE001j重組至入門(mén)載體，獲得入門(mén)克隆。對(duì)兩個(gè)品系中的五個(gè)基因氨基酸序列分析表明，均具有保守的胱氨酸環(huán)、氧負(fù)離子孔(GG)及由Ser、Glu和His構(gòu)成的催化三聯(lián)體，多個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸多態(tài)性；與銅綠麗蠅（L.cuprina）aE7基因E3的G1

12、37等同位點(diǎn)沒(méi)有G137D突變，E3 W251等同位點(diǎn)處，CCE001c及CCE001i在YG和YGF品系里均是L，與銅綠麗蠅E3該位點(diǎn)突變型相同。CCE001i在YG品系中靠近C端有四個(gè)氨基酸的插入，重組病毒成功轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)Sf9細(xì)胞，羧酸酯酶活性初步檢測(cè)顯示，除YG品系中的CCE001i外，其余均檢測(cè)到了活性．利用熒光定量PCR測(cè)定了各重組病毒滴度，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中對(duì)來(lái)自YG和YGF品系的羧酸酯酶CCE001a、CCE001c、CCE001

13、d、CCE001i、CCE001j進(jìn)行了異源表達(dá)。
　　 5．棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶重組蛋白有機(jī)磷水解活性及羧酸酯酶活性的測(cè)定
　　 以熒光化合物dEUP和dMUP對(duì)棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶重組酶蛋白有機(jī)磷水解活性及其摩爾濃度進(jìn)行了測(cè)定。棉鈴蟲(chóng)所有羧酸酯酶重組蛋白有機(jī)磷水解活性，沒(méi)有出現(xiàn)像E3突變后有機(jī)磷活性顯著升高的情況。相對(duì)于E3 WT，僅部分棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶重組蛋白的有機(jī)磷活性升高。001d對(duì)dEUP和dMUP的Kcat值比較接近，而

14、001a、001c，001i、001j則更偏向于水解dMUP，其Kcat值為dEUP的1.8到4.6倍，這種偏好于水解dMUP的特性與銅綠麗蠅E3 W251L相似，001c和001i在兩品系中E3 W251L等同位點(diǎn)為L(zhǎng)，而001a、001j則為F。從而表明，該位點(diǎn)為L(zhǎng)并不是造成這種偏向性的必要條件。
　　 棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶重組蛋白對(duì)a-NA有較p-NPA高的底物特異性。001a、001j、001d對(duì)α-NA有著較高催化活性的，其

15、與E3 W251L等同位點(diǎn)為F；001c、00li催化活性，較低，與E3 W251L等同位點(diǎn)為L(zhǎng)，因此，棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶重組蛋白a-NA水解活性的差異可能與該位點(diǎn)氨基酸差異相關(guān)。001a、001j對(duì)a-NA的催化效率在兩品系間差異不顯著，001c、001d在兩品系間差異顯著，YGF品系約為YG品系的2倍和1.5倍。001c、001j對(duì)p-NPA催化效率在兩品系中差異顯著。001a、001d、001j對(duì)α-NA的底物親和性相對(duì)較高，由此推測(cè)

16、，001a、001d、001j較高的底物親和特性可能通過(guò)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的阻隔作用在抗性中發(fā)揮作用。
　　 6．棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶重組蛋白對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯及其熒光類(lèi)似物的代謝
　　 為了了解棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯水解活性，本研究分別測(cè)定了棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶重組蛋白對(duì)氯氰菊酯、氰戊菊酯及其熒光類(lèi)似物各異構(gòu)體的水解活性。棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶重組蛋白對(duì)氯氰菊酯及氰戊菊酯熒光類(lèi)似物各異構(gòu)體的活性測(cè)定表明：對(duì)氯氰菊酯各立體異構(gòu)體的水解活性存在立體選

17、擇性，即：trans>cis、1(S)>1(R)。總的來(lái)看，對(duì)l(S)trans-α(S)和1(R)trans-α(R)的活性最高，對(duì)其異構(gòu)體它異構(gòu)體活性相對(duì)較低甚至檢測(cè)不到。對(duì)氰戊菊酯各立體異構(gòu)體優(yōu)先水解酸基團(tuán)為2R構(gòu)型的異構(gòu)體，與E3 WT相比，001a、001d、001j對(duì)各異構(gòu)體水解活性有明顯升高，001c僅對(duì)個(gè)別異構(gòu)體有較低的活性。棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶重組蛋白對(duì)氯氰菊酯各異構(gòu)體及順式氰戊菊酯的活性測(cè)定表明：對(duì)氯氰菊酯各異構(gòu)體的水解具