花生溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因的克隆和功能初步研究.pdf

1、花生是重要的油料作物之一，其種子含有豐富的脂肪酸。脂肪酸代謝調(diào)控過程中關鍵酶基因的分離和克隆使得利用遺傳基因工程手段改良脂肪品質(zhì)成為可能，采用基因工程手段有望獲得穩(wěn)定高產(chǎn)、目的脂肪酸含量豐富、滿足各種需求的植物脂肪酸，具有巨大的應用前景和經(jīng)濟價值。
　　 溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)是控制代謝過程中溶血磷脂酸形成不同的磷脂酸的流向的關鍵酶。本文根據(jù)植物溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶保守的氨基酸序列，通過比對同源性較高的區(qū)域，設計改良

2、的簡并引物進行PCR，從花生cDNA文庫中釣取出一個LPAAT基因cDNA片段，再根據(jù)獲得的部分序列設計基因特異性引物，通過cDNA末端快速擴增技術(RACE)獲得該cDNA的3'和5'序列，從而得到全長為1561個堿基的cDNA序列，分析表明該序列具有一個長度為1131bp，編碼376個氨基酸的開放閱讀框(ORF)，生物信息學分析表明該氨基酸序列具有保守的酰基轉(zhuǎn)移酶結構域，將該基因的的氨基酸序列進行比對分析發(fā)現(xiàn)其與蓖麻LPAAT(Ri

3、cinus communis putative lysophosphatidic acid acyltransferaseLPAAT GenBank：ACB30546.1)的氨基酸同源性為90％，和油桐(Vernicia fordiiputative glycerol-3-phosphate acyltransferase GenBank：ACT32030.1)同源相似性為90％，故將其任命為AhLPAA T(Arachis hypog

4、aea Lysophosphatidic AcidAcyltransferase)。并且我們還克隆了該基因的DNA序列(全長為3822bp)，到目前為止，這是花生中第一次成功進行溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因的克隆。
　　 將AhLPAAT的氨基酸序列與各物種進行同源分析，并運用MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。序列分析表明該基因的蛋白編碼區(qū)含有三個跨膜結構域，一個?；D(zhuǎn)移酶功能結構域。我們在大腸桿菌pGEX4T-1原核表達體系中進行誘導表

5、達獲得AhLPAAT基因及其截斷基因的蛋白表達產(chǎn)物，純化蛋白并成功制備了抗體。利用RT-PCR結合qRT-PCR深入研究分析該AhLPAAT在花生各組織中的表達模式。利用洋蔥瞬時表達體系研究AhLPAAT基因表達產(chǎn)物的亞細胞定位，初步表明該蛋白定位在質(zhì)膜上。
　　 運用溫度敏感LPAAT缺陷型大腸桿菌JC201進行溫度互補實驗，陰性結果表明該AhLPAAT不能互補大腸桿菌JC201的功能缺失，初步判斷AhLPAAT不是一類質(zhì)體L