幽門螺桿菌尿素酶B抗原表位的鑒定.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hpylori)是一種螺旋狀、微需氧的革蘭氏陰性桿菌，被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌因子(TypeⅠ carcinogen)。該菌與人的慢性活動性胃炎、胃和十二指腸消化性潰瘍、胃黏膜相關性淋巴組織淋巴瘤(MALT)以及胃腺癌的發(fā)生密切相關。目前臨床上針對Hpylori使用的抗生素治療方法并不理想，有著諸多缺點，因此利用疫苗進行預防接種和治療有望成為控制Hpylori感染行之有效方法。尿素酶B

2、亞單位(UreB)是Hpylori的一個重要保護性抗原，動物模型中也已經(jīng)驗證其作為疫苗抗原的安全性和有效性，尋找鑒定其有效的抗原表位對于Hpylori的診斷、治療和疫苗開發(fā)具有重要的意義。本研究的目的是要篩選出單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所對應的B細胞抗原表位，并對其免疫學功能進行初步研究。本課題共分為以下三部分：
　　 1.抗幽門螺桿菌UreB單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10抗原識別表位的鑒定
　

3、　 通過多次截短法分段表達19段UreB片段，并在此基礎上通過免疫印跡方法逐步確定單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所識別的抗原表位。我們成功構建了19個表達載體且均實現(xiàn)了表達。免疫印跡方法確定了單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所對應的包含15個氨基酸殘基的抗原表位，名稱分別為UP32(GGGTGPADGTNATTI)、UP35(WMLRAAEEYSMNLGF)、UP38(TLHDMGIFSITSSDS)，分別位于H

4、pylori尿素酶B亞單位(UreB)上第158-172、181-195、349-363位氨基酸殘基。所鑒定出來的3個表位通過ELISA得到進一步地證實，純化的融合表位蛋白能與相對應的單抗及臨床感染Hpylori的病人陽性血清發(fā)生特異性的結合反應。以鑒定出來的抗原表位核苷酸序列為依據(jù)，采用化學合成法合成表位多肽，分別命名為UP32、UP35、UP38，純度為90％以上。經(jīng)ELISA或Dotblot方法鑒定，ELISA結果顯示單克隆抗體A

5、1H10、B3D9、A3C10分別與合成肽UP32、UP35、UP38發(fā)生了特異性抗原抗體反應，說明單抗A1H10、B3D9、A3C10所識別的抗原表位分別為UP32、UP35、UP38。Dotblot方法鑒定結果表明單抗B3D9所針對的抗原表位為UP35。ELISA結果顯示合成肽與Hpylori的病人陽性血清也發(fā)生了結合反應，說明病人血清中產(chǎn)生了針對這些表位的抗體。
　　 2.幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)B細胞抗原表位

6、的免疫學功能研究
　　 將純化后的融合表位蛋白免疫小鼠，獲得了較高效價的抗血清，其效價高達1:51200，說明我們構建的融合表位蛋白能夠很好地激發(fā)機體的體液免疫應答。免疫印跡試驗證實融合表位蛋白產(chǎn)生的抗血清能夠與重組的截短片段UreBM及天然的幽門螺桿菌UreB發(fā)生特異性抗原抗體反應。ELISA結果發(fā)現(xiàn)，免疫的鼠抗血清能夠很好地識別相應的表位合成肽，同時也能與天然UreB發(fā)生反應。尿素酶活性抑制試驗表明，單抗A1H10、B3D9

7、、A3C10對尿素酶的活性具有較好抑制作用，抑制率可達70％，多抗血清對尿素酶的活性也有一定的抑制作用，抑制率可達50％。
　　 3.呈現(xiàn)表達串聯(lián)表位及其免疫學評價
　　 通過基因重組的方法，將串連的表位基因片段敲入到本實驗室構建好的減毒沙門菌株S.ty2⊿rfaH⊿ssaV染色體上，與外膜蛋白A7OmpA)的C-端融合表達于載體菌表面，得到重組菌S.ty2⊿rfaH⊿ssaV-U258，通過免疫印跡分析證實目標蛋白獲得

8、了表達。經(jīng)口胃途徑將表達系統(tǒng)Sty2⊿rfaH⊿ssaV-U258免疫小鼠，高、低劑量組都有效地激發(fā)了機體產(chǎn)生針對外源抗原UreB的免疫反應，抗外源抗原的IgG滴度高達1:3200，抗載體菌的IgG滴度為1:800-1:3200，而且也能夠檢測到抗原特異性的分泌型IgA的產(chǎn)生，表明口服免疫的兩組均能刺激機體產(chǎn)生有效的黏膜免疫反應。
　　 總之，本研究通過分子生物學與免疫學結合的方法鑒定出了單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C1