豬痢疾短螺旋體的分離、鑒定與血清抗體ELISA檢測方法的建立.pdf

1、豬痢疾(SwineDysenterySD)是由豬痢疾短螺旋體（Brachyspirahyodysenteriae,B.hyodysenteriae,B.hyo）感染引起的，以大腸黏膜卡他性、出血性及壞死性炎癥、腹瀉、黏液性或黏液出血性下痢為特征的豬腸道傳染病。本病呈世界性分布，一旦侵入豬群，長期存在不易根除，仔豬的發(fā)病率和死亡率都較高，育肥豬患病后生長速度下降，飼料利用率降低，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失。目前，豬痢疾常用的診斷方法主要依

2、賴于病豬臨床癥狀和組織病變的觀察、以及PCR檢測技術，但由于不同感染豬群的臨床癥狀和組織病變差異較大，使臨床診斷舉步為艱;PCR檢測只能確定樣本中是否存在B.hyo的核酸，但不能獲得活的病原體，因此迫切需要建立一套快速又準確的診斷豬群感染B.hyo情況的檢測方法。
　　 利用PCR檢測臨床樣本中B.hyo的保守的NADHoxidase（nox）基因，同時選擇鑒別培養(yǎng)基BAM-SR（BloodAgaroseMediumwithSp

3、ectinomycinandRifampicin，改良的含有壯觀霉素和利福平的血平板），采用厭氧袋厭氧培養(yǎng)法對PCR檢測陽性樣本進行B.hyo的分離培養(yǎng)，對分離培養(yǎng)物進行銀染法快速鏡檢，以及進行16SrRNA基因序列比較與分析。成功的建立了一套實驗室PCR檢測結合厭氧培養(yǎng)的快速分離鑒定B.hyo的方法。從采集的254份臨床豬大腸黏膜和糞便樣品中，PCR檢測出B.hyo陽性樣本13份，成功分離鑒定出1株B.hyo命名為SHB1。
　

4、　 利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，融合表達了具有種屬特異性和免疫原性的豬痢疾短螺旋體外膜脂蛋白Bhlp30.7。優(yōu)化了Bhlp30.7的表達與純化條件。將純化的Bhlp30.7蛋白作為包被抗原，建立了檢測豬血清中B.hyo抗體的間接ELISA方法，并優(yōu)化了間接ELISA檢測方法的各項條件。本實驗融合表達了分子量為30.7KDa的目的蛋白;確立了濃度為0.1MIPTG的最佳誘導濃度和6h的最佳誘導時間;選擇了含100mM咪唑的結合緩沖液純化蛋白

5、;經方陣滴定實驗，確定2μg/mL的抗原為最佳包被濃度，待檢血清稀釋度的最佳稀釋度是200倍。
　　 利用融合表達的Bhlp30.7蛋白作為間接ELISA檢測方法的包被抗原，對上海周邊地區(qū)28個豬場共計609份豬血清樣本進行檢測。對照各個豬場的豬痢疾病史和PCR檢測結果，使用陽性判斷值法(cut-offvalue)處理檢測結果，利用PCR檢測SD陰性和無SD病史豬場來源的血清的相對OD值，計算得到cut-off值為4.28(P＜