基因工程培育抗病(稻瘟病、條紋葉枯病)轉基因水稻.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，但是病害，尤其是稻瘟病、條紋葉枯病，對世界各國稻區(qū)水稻的生產造成了極嚴重的影響。培育水稻抗病新品種，提高植物的廣譜抗性，這是當今農業(yè)發(fā)展的重要研究課題之一，也是關系到國計民生的重大問題。
　　Rs-AFP1基因作為從萌發(fā)的小蘿卜種子內提取的一種多肽，屬于γ-硫堇蛋白，已證明其在離體條件下能夠抑制多種真菌生長；白藜蘆醇是植物處于惡劣環(huán)境下或遭到病原體侵害時，植物自身分泌的一種可抵御病菌感染的抗菌素，

2、作為一種重要的植保素，它能夠增強植物抵抗病原體的能力，并被證明對多種真菌性病害有抑制作用，而白藜蘆醇合成酶作為其合成途徑中的關鍵酶，對植物體內白藜蘆醇合成及代謝具有重要的調控作用。
　　本研究中，我們分別從萌發(fā)的小蘿卜種子及花生未成熟種子 cDNA文庫中分離出Rs-AFP1基因以及白藜蘆醇合成酶基因PNRSC。對這兩個基因進行生物信息學分析，并將它們分別構建入經(jīng)改造的以玉米泛素Ubiquitin為啟動子、以bar基因為選擇標記基因

3、的植物雙元表達載體pCAMBIA1300中，經(jīng)農桿菌介導的方法對黃淮區(qū)主栽品種“圣稻13”的成熟胚進行遺傳轉化并獲得13株轉Rs-AFP1基因的植株以及7株轉PNRSC基因的植株。通過除草劑Basta涂抹以及PCR分子鑒定，確定轉化Rs-AFP1基因的第1、4、6、7、10、13株系為陽性轉基因植株，轉化PNRSC基因的第1、2、3、4、5、6株系為陽性轉基因植株，并進一步對鑒定為陽性的轉基因植株提取總蛋白液進行稻瘟病菌體外的抗性鑒定、

4、田間自然發(fā)病情況下的抗病性檢測以及對轉基因植株進行室內苗期稻瘟病菌接種性鑒定，初步研究結果表明，各陽性轉基因植株的總蛋白提取液在體外對稻瘟病菌具有一定程度上的抑制作用；在田間自然發(fā)病情況下，野生型圣稻感染了稻瘟病，而相同生長條件下的各陽性轉基因株系均未感??；對T1代陽性轉基因株系的三葉一心期進行室內稻瘟病菌接種性鑒定，轉化 Rs-AFP1基因的各陽性株系中，除第10株系表現(xiàn)為感病外，其余均表現(xiàn)為抗病，轉化PNRSC基因的各陽性株系中，除

5、第2株系表現(xiàn)為感病外，其余均表現(xiàn)為抗病。由此可見，外源Rs-AFP1基因及白藜蘆醇合成酶基因PNRSC的導入均可在一定程度上提高目標植物對病害的耐性及抗性，從而為水稻抗稻瘟病轉基因新品種的培育提供了候選材料。
　　水稻條紋葉枯病病毒即RSV的基因組由4個獨立的單鏈RNA大分子組成，按照分子量大小分別命名為RNA1～RNA4。利用由pUC19改造的具有兩對同尾酶的RNAi載體分別與RSV的單鏈RNA正向和反向連接，中間含有一段內含子

6、，從而使正鏈和反鏈互補形成一個發(fā)夾結構，根據(jù)RNA干擾的原理，該表達載體導入植物體后如遇到RSV的侵染，將產生使RSV的單鏈RNA沉默的結果，從而使其無法表達而喪失致病性。研究中我們根據(jù)RSV的4個單鏈RNA分別設計了12對引物，利用感染病毒的水稻葉片所提取的RNA為模板，通過RT-PCR以及PCR技術克隆出5個水稻條紋葉枯病毒不同的cDNA片段，將它們分別命名為OsRSV(1-5)，然后構建RNA干擾載體，利用農桿菌介導法轉化黃淮區(qū)主

7、栽品種“圣稻13”，獲得了4株轉OsRSV1片段的轉基因植株、6株轉OsRSV2片段的轉基因植株、5株轉OsRSV3片段的轉基因植株、7株轉OsRSV4片段的轉基因植株、11株轉OsRSV5片段的轉基因植株，通過除草劑Basta涂抹以及PCR分子鑒定確定陽性轉基因株系，并對鑒定為陽性的轉基因株系進行田間自然發(fā)病情況下的抗病性觀察。初步結果表明，野生型圣稻感染了條紋葉枯病，而相同生長條件下的各陽性轉基因株系均未感病。接下來我們將對各陽性轉

8、化材料進行抗蟲性、抗病性鑒定，進而篩選出抗病有效區(qū)段，為進一步培育抗條紋葉枯病的水稻新品系提供材料。
　　綜上所述，本研究利用基因工程手段解決稻瘟病、條紋葉枯病相關的水稻病害問題，并對獲得的轉基因陽性的黃淮稻區(qū)水稻主栽品種進一步進行抗病能力的篩選及檢測，以期能培育并獲得抗稻瘟病、抗條紋葉枯病能力提高的轉基因水稻新品種。該方面的工作是保障我國未來食物安全、人民健康的需要，也是環(huán)境保護、能源替代的需要，更是轉基因技術產業(yè)化發(fā)展的需要。