千山蘇云金芽孢桿菌的分離與cry基因克隆.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt）是一種具有高度特異性，對(duì)環(huán)境友好的微生物殺蟲(chóng)劑，其主要?dú)⑾x(chóng)活性與其攜帶的編碼殺蟲(chóng)晶體蛋白（InsecticidalCrystalProteins，ICPs）的cry基因密切相關(guān)，因此，cry基因研究便成為近幾年研究的熱點(diǎn)。到目前為止，國(guó)際上已經(jīng)克隆了524種殺蟲(chóng)蛋白基因，但是隨著B(niǎo)t應(yīng)用的不斷擴(kuò)大，隨之出現(xiàn)了殺蟲(chóng)晶體蛋白有殺蟲(chóng)譜窄，殺蟲(chóng)活性低的缺點(diǎn)，而且部分害蟲(chóng)已經(jīng)產(chǎn)生抗

2、性。因此，尋找新的高毒力菌株及基因是解決昆蟲(chóng)抗性問(wèn)題的有效途徑之一。
　　 本研究從遼寧省千山三個(gè)不同區(qū)域的土樣225份分離得到22株蘇云金芽孢桿菌，分離率為9.8％。伴孢晶體的類(lèi)型有菱形、球形、不定形。利用16對(duì)通用引物PCR方法對(duì)以上分離的22株菌株進(jìn)行cry型的鑒定：其中有6株菌株含有cry1類(lèi)基因，表達(dá)134kD的蛋白；有2株菌株含有cry7類(lèi)基因，表達(dá)130kD的蛋白。
　　 在對(duì)QZG121株的PCR中發(fā)現(xiàn)了

3、cry7類(lèi)基因，有文獻(xiàn)報(bào)道cry7對(duì)鞘翅目、鱗翅目、直翅目害蟲(chóng)有活性，經(jīng)過(guò)PMD18-T載體克隆，核苷酸序列測(cè)定后經(jīng)NCBIBLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該菌株中含有cry7Ab基因。根據(jù)已知的cry7Ab全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，成功克隆了該基因。該基因編碼區(qū)長(zhǎng)3417bp，用軟件翻譯出1138個(gè)氨基酸殘基，分子量為130kD。該基因核苷酸序列已經(jīng)在國(guó)際基因庫(kù)GeneBank中登記，其登錄號(hào)為吼1936713，并由Btδ-內(nèi)毒素基因國(guó)際命名委

4、員會(huì)正式命名為cry7Ab9。
　　 同時(shí)，根據(jù)因公布cry1Ac基因的兩端序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物Q5UNX/QU3UNX，在菌株Q12中克隆cry1Ac的全長(zhǎng)基因。該基因被Btδ-內(nèi)毒素基因國(guó)際命名委員會(huì)正式命名為cryAc28。cry1Ac28編碼區(qū)長(zhǎng)3537bp，由1178氨基酸組成，分子量為134kD。該基因核苷酸序列已經(jīng)在國(guó)際基因庫(kù)GeneBank中登記，其登錄號(hào)為FJ198072。
　　 通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體，獲得