斜紋夜蛾轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究.pdf

1、piggy Bac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)已成為在轉(zhuǎn)基因昆蟲中使用最廣的轉(zhuǎn)座子，已被證明能在20多種昆蟲中轉(zhuǎn)座。斜紋夜蛾屬鱗翅目昆蟲，是世界性分布害蟲。本研究通過(guò)顯微注射進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，利用鱗翅目來(lái)源的轉(zhuǎn)座子piggyBac建立高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因斜紋夜蛾技術(shù)體系，為今后利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)控制斜紋夜蛾的危害、應(yīng)用于斜紋夜蛾基因的功能以及探明其發(fā)育過(guò)程的基因調(diào)控機(jī)理等基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 1）本研究使用液壓顯微系統(tǒng)，通過(guò)制備特制注射針和選取合適的注射方

2、式，突破斜紋夜蛾堅(jiān)硬卵殼的阻礙，建立起一套適合斜紋夜蛾的基因轉(zhuǎn)移方法。使用該方法，在熟練的基礎(chǔ)上，每小時(shí)可注射200～300粒卵。
　　 2）將注射后的卵置于飽和濕度的環(huán)境中一段時(shí)間后，注射孔的傷口能夠逐漸愈合，保護(hù)卵不會(huì)因?yàn)樽⑸涠鴮?dǎo)致其水分的流失。飽和濕度處理后幼蟲的孵化率和胚胎后期率分別達(dá)到40.9％和61.3％，其效果顯著優(yōu)于膠水封口處理和75％飽和濕度處理。
　　 3）對(duì)發(fā)育時(shí)期相同的卵，分別在其前后極注射相同濃

3、度和比例的piggyBac和helper。結(jié)果表明，與在卵前極注射相比，在卵后極部位注射后piggyBac的轉(zhuǎn)座率更高。
　　 4）對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的卵注射顯微緩沖液，發(fā)現(xiàn)幼蟲孵化率在5 h前隨時(shí)間延后而逐漸提高，5 h后孵化率趨于相同。
　　 5）顯微操作各環(huán)節(jié)中，注射過(guò)程中的機(jī)械傷害對(duì)胚胎造成較大傷害，顯微緩沖液對(duì)胚胎的傷害小于TE緩沖液。隨著注射質(zhì)粒DNA濃度的增加，卵內(nèi)熒光表達(dá)率逐漸升高，而孵化率逐漸降低；質(zhì)粒濃度

4、超過(guò)100 ng/μl的對(duì)幼蟲孵化率的影響較大，質(zhì)粒濃度在100 ng/μ1～170ng/μl，對(duì)幼蟲孵化的影響趨于緩和。
　　 6）將濃度為140～170 ng/μl、1:1混合的piggybac和helper的混合質(zhì)粒注射進(jìn)入早期胚胎發(fā)育的卵中。在藍(lán)色熒光下觀察和記錄EGFP在胚胎、幼蟲及蛾中的表達(dá)情況，并對(duì)表達(dá)綠色熒光的個(gè)體進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在胚胎的各個(gè)時(shí)期、G0代及其后代的1～3齡幼蟲和蛾的復(fù)眼中都觀察到了EGFP表達(dá)

5、的綠色熒光。篩選出的轉(zhuǎn)基因蟲在其第四代仍能觀察到EGFP的表達(dá)。利用PCR技術(shù)對(duì)表達(dá)EGFP的個(gè)體進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性個(gè)體能擴(kuò)增出EGFP片段，而陰性對(duì)照則不能，并在GO轉(zhuǎn)基因幼蟲的表皮、中腸、脂肪體及蛹的中腸均檢測(cè)到。EGFP的存在。這表明：EGFP已通過(guò)plggybac整合到斜紋夜蛾的基因組中并表達(dá)，且能夠穩(wěn)定遺傳。
　　 7）將注射piggyBac后5 h內(nèi)卵的孵化率、熒光表達(dá)率及GO轉(zhuǎn)基因蟲獲得率按注射時(shí)間排序，發(fā)現(xiàn)在3

6、h左右注射可獲得最好的轉(zhuǎn)基因效率，轉(zhuǎn)基因蟲的獲得率與卵內(nèi)熒光表達(dá)率緊密相關(guān)。
　　 8）本實(shí)驗(yàn)共注射受精卵2576粒，注射piggyBac后，觀察到有綠色熒光表達(dá)的卵數(shù)為507粒，占注射總卵數(shù)的19.7％；注射后孵化出幼蟲424條，孵化率為16.4％。在孵化的424條幼蟲中，經(jīng)在熒光顯微鏡下篩選，共獲得46條發(fā)綠色熒光的GO代轉(zhuǎn)基因幼蟲，占注射卵數(shù)的1.78％。國(guó)際上昆蟲轉(zhuǎn)基因效率普通較低，盡管本研究得到的斜紋夜蛾轉(zhuǎn)基因效率已達(dá)