致鴨產(chǎn)蛋下降的呼腸孤病毒ZY-AH-1-2011株的分離、鑒定及油乳劑滅活疫苗研制.pdf

1、呼腸孤病毒可感染雞、鴨、鵝等多種家禽，所表現(xiàn)的臨床癥狀呈現(xiàn)出多樣性和復(fù)雜性。從2010年6月起，在我國南方地區(qū)的鴨群中流行一種以產(chǎn)蛋下降為主要特征的傳染病，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從發(fā)病鴨群中分離到一株與已報(bào)道的其它鴨源分離株致病特性不同的呼腸孤病毒，命名為ZY/AH/1/2011株，利用該毒株研制了油乳劑滅活疫苗并進(jìn)行了初步的免疫效力評價(jià)。
　　1致鴨產(chǎn)蛋下降的呼腸孤病毒ZY/AH/1/2011株的分離與鑒定

2、　　從安徽樅陽某發(fā)生產(chǎn)蛋下降的鴨群中采集病料，接種12日齡鴨胚。收獲死亡鴨胚絨毛尿囊膜和尿囊液，除呼腸孤病毒呈PCR檢測陽性外，未檢出其他病毒混合感染。取感染鴨胚尿囊液和胚體分別進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染和超薄切片，經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，尿囊液和組織中均可見直徑約70 nm的球形、無囊膜、具雙層衣殼結(jié)構(gòu)的病毒粒子，與禽呼腸孤病毒(ARV)粒子的形態(tài)相符。將分離毒株分別經(jīng)氯仿、不同溫度和不同酸堿度環(huán)境處理后接種鴨胚發(fā)現(xiàn)，該病毒對氯仿較敏感，對熱、pH3及p

3、H9有抵抗力。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的ARVσB基因序列設(shè)計(jì)一對引物，以收獲的感染鴨胚尿囊液提取的總RNA為模板，通過RT-PCR方法擴(kuò)增出一條大小約為980 bp的目的條帶，測序結(jié)果顯示與ARV的σB基因同源。根據(jù)以上結(jié)果可以將分離毒株鑒定為呼腸孤病毒，命名為ZY/AH/1/2011株。
　　遺傳進(jìn)化分析顯示，ZY/AH/1/2011株σB基因與已報(bào)道的其它鴨源ARV分離株的σB基因核苷酸序列同源性僅為57.5％～64.8％

4、,在遺傳進(jìn)化樹上位于不同的進(jìn)化分支;氨基酸序列同源性僅為58.0％～64.8％，而且在130 aa～139aa處的抗原表位存在明顯差異。
　　將ZY/AH/1/2011毒株用132日齡產(chǎn)蛋鴨進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室人工感染試驗(yàn)，攻毒后產(chǎn)蛋率迅速從70％下降到20％左右，剖檢大體病變與臨床病例相似，主要表現(xiàn)為卵子變形、變性和輸卵管萎縮。病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示:發(fā)病鴨卵巢局部壞死，有少量含鐵血黃素和大量的異嗜性粒細(xì)胞浸潤;輸卵管水腫，黏膜下層及間質(zhì)

5、有程度不等的炎性細(xì)胞浸潤，黏膜假復(fù)層柱狀上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)層上皮細(xì)胞，細(xì)胞核呈扁平狀;脾臟中有大量的淋巴細(xì)胞浸潤。
　　根據(jù)以上結(jié)果可以判定:呼腸孤病毒ZY/AH/1/2011株與已報(bào)道的其它鴨源呼腸孤病毒在致病性方面存在顯著差異，以引起鴨產(chǎn)蛋下降為主要特征。
　　2鴨呼腸孤病毒油乳劑滅活疫苗的研制
　　將呼腸孤病毒ZY/AH/1/2011株接種雞胚后收獲雞胚的尿囊液和絨毛尿囊膜，勻漿后以β-丙內(nèi)酯滅活作為抗原，按常規(guī)方

6、法制備油乳劑滅活疫苗，經(jīng)物理性狀檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn)，油乳劑滅活疫苗的各項(xiàng)指標(biāo)均合格。
　　在免疫保護(hù)效力試驗(yàn)中，120只產(chǎn)蛋鴨被隨機(jī)分為四組，每組30只，分別為免疫攻毒組、免疫未攻毒組、未免疫攻毒組和健康對照組。疫苗免疫于130日齡進(jìn)行，免疫劑量為0.5 mL/只，免疫途徑為頸部皮下接種，免疫后14天用ZY/AH/1/2011株攻毒，每日統(tǒng)計(jì)各組產(chǎn)蛋情況，連續(xù)觀察15天后撲殺所有試驗(yàn)鴨并進(jìn)行剖檢。結(jié)果顯示:免疫未攻毒組與健康對照組相

7、比，產(chǎn)蛋率未出現(xiàn)明顯變化，說明疫苗免疫接種安全性良好，對試驗(yàn)鴨無明顯副反應(yīng);未免疫攻毒組試驗(yàn)鴨攻毒后產(chǎn)蛋率迅速下降至16.7％，與未免疫攻毒組相比，免疫攻毒組的試驗(yàn)鴨得到良好的保護(hù)，試驗(yàn)期間平均產(chǎn)蛋率為70％，與健康對照組差異不顯著。通過間接ELISA方法檢測免疫后鴨呼腸孤病毒抗體水平的變化，結(jié)果顯示免疫后第7天的抗體陽性率即可達(dá)到100％，抗體效價(jià)在免疫后第21天達(dá)到高峰。
　　上述結(jié)果表明，本研究所研制的鴨呼腸孤病毒ZY/AH