葡萄無核相關(guān)基因表達(dá)、克隆及VνMADS46基因功能分析.pdf

1、葡萄（Vitis vinifera L.）是一種重要的經(jīng)濟(jì)果樹，在國內(nèi)外栽培面積很廣。由于無核葡萄在鮮食水果中具有食用方便，口味極佳，營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，所以深受消費(fèi)者青睞，在鮮食、制千方面具有很廣闊的市場。近年來無核葡萄在世界鮮食葡萄中消費(fèi)量有逐年上升的趨勢，世界各葡萄生產(chǎn)大國對無核葡萄的研究與開發(fā)也逐漸加強(qiáng)，因此開展葡萄無核基因發(fā)掘及其功能研究具有重要的意義。本研究正是依據(jù)課題組前期通過有核和無核葡萄雜交后代進(jìn)行的葡萄轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出

2、27個表達(dá)差異比較明顯的基因，驗證了這27個候選基因在胚珠敗育前后三個關(guān)鍵時期的表達(dá)情況，并在無核葡萄‘無核白’和有核葡萄‘紅地球’中克隆了5個表達(dá)差異比較大的基因，分析了這5個基因DNA序列的相似性，同時構(gòu)建了VvMADS46基因的亞細(xì)胞定位載體和過表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化洋蔥和番茄，并對轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行功能研究，初步分析了VvMADS46的基因功能。獲得了主要以下結(jié)果:
　　1.采用半定量PCR技術(shù)分析了27個無核候選基因在多種有核和

3、無核葡萄材料胚珠發(fā)育不同時期的表達(dá)情況，其中20個基因（HB1、GRAS、AP2-2、HB2、MYB1、MYB2、NAC26、GPDC、SCD1、MADS46、TLP2、SCD2、AN1、P450-1、NAC2、Knlike3、VVSTM、KAN1-2、GH3-1、TLP1）在無核葡萄材料胚珠中表達(dá)量較高，在有核葡萄材料胚珠中表達(dá)量低，而另外7個基因(NA C86、DDM、C2H2-1、C2H2-2、NAC41、GH3-9、GSLG)則

4、在有核葡萄材料胚珠中表達(dá)量相對較高，這些基因的差異表達(dá)反應(yīng)了它們與葡萄無核調(diào)控可能存在一定關(guān)系。
　　2.在無核葡萄‘無核白’和有核葡萄‘紅地球’中克隆了5個在無核葡萄及有核葡萄材料胚珠中表達(dá)差異比較大的基因MYB1、MYB2、NAC26、NAC41、HB1，基因全長大小分別為1686bp、1090bp、1054bp、1055bp和1657bp，測序結(jié)果顯示在‘紅地球’和‘無核白’中這些基因序列無明顯差異。
　　3.分析了V

5、vMADS46基因在‘無核白’和‘紅地球’的不同組織器官的表達(dá)情況，結(jié)果表明，VvMADS46在根、莖、葉、花序、花、卷須、果實等不同組織中均有表達(dá)，在花和花序中的表達(dá)量較高，在果實中的表達(dá)量次之，而在莖、葉和卷須中的表達(dá)量較低;同時在‘無核白’和‘紅地球’兩種不同材料中克隆了VvMADS46基因cDNA序列，比較了其序列差異，VvMADS46開放閱讀框長度為618bp，編碼206個氨基酸;并構(gòu)建了VvMADS46基因的過量表達(dá)載體及亞

6、細(xì)胞定位載體，分別侵染轉(zhuǎn)化番茄子葉和洋蔥表皮細(xì)胞，后期觀察發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)VvMADS46基因的番茄果實及番茄種子都明顯變小，表明VvMADS46與無核葡萄種子生長發(fā)育調(diào)控可能存在一定關(guān)系，熒光定位觀察結(jié)果顯示VvMADS46定位在植物細(xì)胞核上。另外在‘無核白’和‘紅地球’兩種不同材料中分別克隆了VvMADS46基因的啟動子，分析了該基因的元件調(diào)控，序列比對發(fā)現(xiàn)在‘無核白’啟動子中缺少了一個與胚乳發(fā)育相關(guān)的調(diào)控元件，該元件可能與VvMAD