豬體細胞核移植轉基因技術的研究.pdf

1、豬體細胞核移植轉基因技術在人的動物疾病模型和人類異種器官移植方面具有巨大優(yōu)勢和應用潛力，同時還有望豬育種中應用，甚至生產“環(huán)保豬”。它現(xiàn)在已經成為研究的熱點。本研究以建立高效的豬體細胞核移植轉基因技術體系為目的，并嘗試構建轉植酸酶基因胚胎，為以后生產“環(huán)保豬”打下堅實的基礎。
　　 本試驗比較觀察第一極體(The first polar body, pbⅠ), Oosight imaging system觀察和hocchst33

2、342染色法對第二次減數(shù)分裂中期（MetaphaseⅡ, MⅡ）卵母細胞判定結果的相關性分析，并探討卵巢皮質細胞(porcine ovarian cortex cells, pOCCs)，豬輸卵管上皮細胞(porcine oviductal epithelial cells, pOECs)和豬卵丘顆粒細胞(porcine cumulus cells,pCCs)三種單層細胞體外共培養(yǎng)體系對豬去卵丘卵母細胞(cumulus cells de

3、nuded oocytes，Dos)體外成熟(in vitro maturation, IVM)和孤雌發(fā)育的影響。結果顯示：(1) Oosight imaging system判定卵母細胞成熟的結果與hocchst33342染色法判定的結果有很強相關性(R=0.973,P＜0.01,N=90)；(2)pOCCs單層細胞共培養(yǎng)體系中豬去卵丘卵母細胞成熟率顯著高于pOECs（52.5±0.30％vs43.8±2.18％,P＜0.05），且這

4、兩組成熟率顯著高于其余各組(P＜0.05)；Dos在三種單層細胞共培養(yǎng)體系培養(yǎng)后，成熟卵母細胞GSH含量較非共培養(yǎng)組都能顯著升高(P＜0.05),pOCCs組GSH含量最高（7.1±0.32pmol/卵）；(3)成熟后的Dos經孤雌激活，pOCCs組和pOECs組卵裂率和囊胚率都顯著高于其余兩組(P＜0.05)。
　　 建立了楓涇豬的35d胎兒成纖維細胞系、成年耳成纖維細胞系，輸卵管上皮細胞系，并分離培養(yǎng)了豬卵泡液中的顆粒細胞。

5、且比較了脂質體介導法中DNA含量、脂質體含量和孵育時間對轉染效率的影響。結果顯示，四種細胞系通過24孔板內細胞匯合85％～90％,1.0μgDNA和2.4μL脂質體的用量，孵育4h轉染YM6552質粒效率最高。且四種細胞系對脂質體介導法條件要求一致。其中胎兒成纖維細胞的轉染效率最高。
　　 在體細胞核移植轉基因過程中，我們通過LipofectamineTM2000介導YM6552質粒轉染四種供核細胞，并且采用G418對其進行篩選