中華絨螯蟹表達序列標簽(EST)分析及免疫相關(guān)基因的克隆、表達模式研究.pdf

1、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是我國的重要增養(yǎng)殖對象之一。近年來,隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和集約化程度的提高,由細菌、病毒和類立克次體生物等引起的各種病害日趨嚴重,給中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。至今,病害仍然是困擾其養(yǎng)殖業(yè)的一個重要因素。除改善環(huán)境因素外,提高機體自身免疫力和抗病力是解決這一難題的一個重要方法。本論文試圖從分子角度來研究中華絨螯蟹的免疫防御機制,以其為這一重要方法提供堅實的理論基礎(chǔ)。本研究借助分

2、子生物學和生物信息學手段,首次完成對中華絨螯蟹血細胞cDNA文庫的構(gòu)建和表達序列標簽(EST)的分析,不僅豐富了中華絨螯蟹的基因數(shù)據(jù),同時篩選出許多與免疫相關(guān)的基因序列。在此基礎(chǔ)上,通過cDNA末端快速擴增(RACE)和實時定量PCR技術(shù)進一步對主要的免疫相關(guān)基因進行了克隆和表達模式分析,這些研究為了解中華絨螯蟹免疫機制提供了基礎(chǔ)資料,同時也為蟹病的防治提供了新思路。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用常規(guī)cDNA文庫構(gòu)建

3、技術(shù),成功構(gòu)建了滴度為4.50×10~6CFU/mL,庫容為3.3×10~6CFU/mL,重組率為73％的中華絨螯蟹血細胞cDNA文庫;從文庫中隨機挑取了3,118個克隆進行5’-端單向測序,經(jīng)去除低質(zhì)量和污染序列后,共得到3,041條高質(zhì)量EST序列,這些序列的平均長度為561bp。經(jīng)拼接后獲得了1,049條unique序列,包括292條重疊群(Contig)和757條單一序列(Singleton)。通過比對發(fā)現(xiàn)有488條Unique

4、序列被注釋成已知的功能基因,551條Unique序列未被注釋任何功能;通過Gene Ontology功能分類發(fā)現(xiàn)了26個中華絨螯蟹先天性免疫反應(yīng),如參與酚氧化酶系統(tǒng)的絲氨酸蛋白酶、Kazal-型蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、α-巨球蛋白、酚氧化酶原激活因子以及酚氧化酶酶原,參與凝集反應(yīng)的谷胱酰胺轉(zhuǎn)移酶,與抗氧化系統(tǒng)相關(guān)的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶以及谷胱甘肽過氧化物酶,抗菌肽類的抗脂多糖因子、甲殼素、以及Osmotin,模式識別

5、分子類的C-型凝集素、甘露糖結(jié)合蛋白、脂多糖和β-1,3葡聚糖結(jié)合蛋白、Toll受體蛋白。通過EST表達豐度分析發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹血細胞主要免疫相關(guān)基因為Kazal-型蛋白酶抑制劑和C-型凝集素。
　　2.模式識別蛋白及其功能的研究是當前甲殼動物免疫學的研究重點之一,許多物種的模式識別蛋白及其功能已經(jīng)明確。本研究根據(jù)EST提供的信息,采用RACE技術(shù)成功克隆了中華絨螯蟹一種模式識別蛋白-脂多糖和β-1,3葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBP)基

6、因全長cDNA序列。生物信息學分析發(fā)現(xiàn),該序列全長為1,236bp,包括26 bp的5’-末端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(5’-UTR),1,089 bp的開放閱讀框(ORF)和121bp的3’-末端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3’-UTR),共編碼362個氨基酸,包含一個由15個氨基酸組成的信號肽;蛋白序列與中國明對蝦(Penaeus chinensis)、細角濱對蝦(Litopenaeus stylirostris),凡納濱對蝦(Litopenaeus vanname

7、i)和淡水螯蝦(Pacifaxtacus leniusculus)LGBP的相似性分別為67%、66%、66%、61%;該基因編碼蛋白含有幾個保守的區(qū)域,如整合素結(jié)合區(qū),激酶C磷酸化位點,N—連接的糖基化位點等,另外還發(fā)現(xiàn)了一個水解酶位點。實時定量PCR結(jié)果顯示,LGBP基因mRNA在中華絨螯蟹肝胰腺、鰓、肌肉、血細胞、胃和腸中均有表達,其中在血細胞中的表達量最高。用嗜水氣單胞菌進行急性感染實驗發(fā)現(xiàn),LGBP在血細胞中的表達量在感染后1

8、.5 h達到最高水平,與對照組相比存在顯著性差異(P＜0.05),而后表現(xiàn)為下降趨勢,在感染后12 h恢復(fù)到起始水平,說明該基因參與了中華絨螯蟹的抗病過程。
　　3.酚氧化酶原激活酶(PPAF)的活化以及PPAF活化酚氧化物酶原是酚氧化物酶系統(tǒng)行使非特異性免疫功能的關(guān)鍵步驟。本研究成功克隆了中華絨螯蟹PPAF基因全長cDNA序列。該序列全長為1,386 bp,其中包括154 bp 5’-UTR,1,134bp ORF和95 bp

9、3’-UTR,編碼378個氨基酸。該編碼蛋白含有信號區(qū)域、半胱氨酸折疊區(qū)域和保守的絲氨酸區(qū)域。該。PPAF氨基酸序列與其它無脊椎動物PPAF氨基酸序列相比,具有很高的相似性(55%-75%)。PCR結(jié)果分析表明肝胰腺、肌肉、腸道、鰓中均有PPAF的表達。嗜水氣單胞菌急性感染后6 h、12 h、48 h,與對照組相比PPAF基因mRNA表達水平均顯著增加(P＜0.05)。結(jié)果表明PPAF與機體對外來病源的防御作用密切相關(guān)。
　　4.

10、作為抗氧化酶類,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)在清除體內(nèi)過多的氧自由基、保護細胞免受氧化損傷等方面起非常重要的作用。本研究在EST序列的基礎(chǔ)上,通過RACE技術(shù)獲取了這三種酶基因全長cDNA序列。其中,SOD基因cDNA全長為1,339 bp,包括20 bp 5’-UTR,867 bp ORF和452 bp 3’-UTR,共編碼288個氨基酸,沒有信號肽序列,但含有Mn-SOD的

11、標記保守序列(DVWHHAYY),說明該SOD屬于Mn-SOD。序列比對發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹Mn-SOD與凡納濱對蝦(L.vannamei)、班節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、藍蟹(Callinectes sapidus)和羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)、克氏原螯蝦(Procambarus clarkia)的Mn-SOD相似性分別為90%、89%、87%、84%和81%。SOD基因在各組織均有表達,

12、其中在血細胞中表達量最高,而其他組織中表達量相對比較低,結(jié)果提示中華絨螯蟹SOD基因主要在血細胞中表達。以嗜水氣單胞菌急性感染中華絨螯蟹,血細胞SOD基因mRNA的表達在感染后1.5 h達到最高,之后開始下降并在12 h達到最低點,12 h后表達量又開始升高,至48 h時表達量同1.5 h的表達量基本相同。但是1.5 h、12 h、48 h感染組的表達量與對照組之間SOD基因mRNA的表達水平不存在顯著性差異(P＞0.05)。GPx基因

13、cDNA全長為1,101 bp,其中包括94 bp 5’-UTR,660 bp ORF和347bp 3’-UTR。該ORF編碼219個氨基酸,沒有信號肽序列。ORF中沒有發(fā)現(xiàn)編碼硒半胱氨酸的序列(TGA),說明該GPx屬于不含Se的GPx。該序列含有典型的過氧化物結(jié)構(gòu)域,烷基過氧化還原蛋白(AhpC)結(jié)構(gòu)域,硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)域。序列比對發(fā)現(xiàn),該基因氨基酸序列與鋸緣青蟹(Scylla serrata)、地中海海綿(Suberites d

14、omuncula)和繁茂膜海綿(Hymeniacidon perlevis)GPx氨基酸序列相似性分別為81%、67%和66%。GPx基因mRNA在各組織均有表達,其中在肝胰腺中表達量最高,而血細胞中表達量相對比較低。結(jié)果提示中華絨螯蟹的GPx基因主要在肝胰腺中表達。嗜水氣單胞菌感染中華絨螯蟹不同時間后,GPx基因mRNA在血細胞中的表達呈現(xiàn)下調(diào)作用。在感染后1.5 h,GPx基因mRNA表達量顯著性低于對照組(P＜0.05),隨著感染

15、時間的延長,感染組GPx基因mRNA表達量雖然有所提高,但仍顯著性低于對照組。
　　結(jié)果提示,病菌的感染可能抑制了中華絨螯蟹的GPx的表達。GST基因cDNA全長為958 bp,包含85 bp 5’-UTR,651 bp ORF和222 bp3’-UTR。該ORF編碼216個氨基酸,其中含有一個由17個氨基酸組成的信號肽。序列比對發(fā)現(xiàn),該蛋白氨基酸序列與赤擬谷盜(Tribolium castaneum)和致倦庫紋(Culex qu

16、inquefasciatus)GST相似性為53%、與大劣按蚊(Anopheles dirus)和庫蠓(Culicoides variipennis)GST相似性為52%、與瘧蚊(Anopheles gambiae)GST相似性為51%。該蛋白氨基酸序列含有一個82個氨基酸組成的G-位點和126個氨基酸組成的H-位點,另外也含有一個蛋白酶磷酸化位點和一個N-連接的糖基化位點。相似性和系統(tǒng)發(fā)生分析表明該GST屬于delta-GST。通過實