柑橘潰瘍病菌全基因組測(cè)序與比較基因組分析.pdf

1、柑橘潰瘍病是柑橘生產(chǎn)上主要的細(xì)菌性病害，嚴(yán)重影響樹(shù)勢(shì)生長(zhǎng)、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)造成了巨大的損失。該病害是由地毯草黃單胞桿菌柑橘致病變種（Xanthomonas axonopodispv.citri,Xac）所引起，近年來(lái)隨著DNA測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，基因組學(xué)的研究逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。本研究選取采自江西的感染潰瘍病菌的臍橙進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，利用Illumina Miseq二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行病原菌全基因組測(cè)序，通過(guò)比較基因組學(xué)方法

2、分析潰瘍病菌A菌株和AW菌株的宿主范圍和毒性差異的分子機(jī)制。主要取得以下幾方面的研究進(jìn)展：
　　1、柑橘潰瘍病菌全基因組測(cè)序與分析
　　本研究利用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)分離的jx-6菌株進(jìn)行了全基因組序列的測(cè)序，并對(duì)其基因組缺口進(jìn)行了人工修補(bǔ)、序列拼裝和注釋?zhuān)@得一個(gè)環(huán)狀基因組序列（GenBank登錄號(hào)：CP011827.1）和兩個(gè)質(zhì)粒序列（GenBank登錄號(hào)分別為：CP013664.1和CP013665.

3、1)。jx-6菌株基因組大小為5,124,792bp，平均GC含量為64.8％，編碼4357個(gè)CDS，54個(gè)tRNA和6個(gè)核糖體16S-23S-5S rRNA操縱子，同時(shí)還對(duì)jx-6菌株基因組中的插入序列、分泌系統(tǒng)、基因島、噬菌體相關(guān)編碼基因、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）等進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析并通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，在jx-6基因組中，預(yù)測(cè)到了1

4、4個(gè)可信的IS（Insertion Sequence）元件，42個(gè)基因島區(qū)域，3個(gè)前噬菌體區(qū)域和5個(gè)CRISPR位點(diǎn)。
　　2、柑橘潰瘍病菌比較基因組學(xué)分析
　　將本研究中測(cè)序菌株 jx-6與 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)公布全基因組的菌株中選取的2株A菌株（gd3，GenBank收錄號(hào)：CP009016.1和306，GenBank收錄號(hào)：AE008923.1)和2株AW菌株（AW12879，GenBank收錄號(hào)：CP0037

5、78.1和AW13，GenBank收錄號(hào)：CP009031.1)進(jìn)行比較基因組學(xué)分析。直系同源基因聚類(lèi)分析表明5個(gè)菌株核心基因簇共3887個(gè)，只有AW菌株具有特異基因簇，特異基因簇為216個(gè)。對(duì)這些特異基因簇進(jìn)行分析結(jié)果顯示大部分與生物代謝和細(xì)胞代謝過(guò)程有關(guān)?；蚪M共線(xiàn)性分析結(jié)果顯示AW菌株基因組存在翻轉(zhuǎn)、易位、倒位等基因組重排事件。另外，對(duì)A菌株和AW菌株的全基因組進(jìn)行前噬菌體預(yù)測(cè)分析，表明A菌株基因組中都含有3個(gè)前噬菌體區(qū)域，AW菌

6、株基因組中都含有5個(gè)前噬菌體區(qū)域。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn) A菌株中的prophage2與AW菌株中的prophage2屬于同一種噬菌體，其中AW菌株中的prophage4和prophage5兩個(gè)前噬菌體區(qū)域正好插入在兩個(gè)菌株共線(xiàn)性程度較低的部分。這些前噬菌體的插入及基因組重排有可能是導(dǎo)致AW菌株寄主專(zhuān)化性的原因所在。
　　3、柑橘潰瘍病菌中CRISPR/cas系統(tǒng)的分析
　　原核生物中，CRISPR/cas系統(tǒng)對(duì)外來(lái)的質(zhì)粒和噬菌體序列

7、具有抵抗作用，是一串包含多個(gè)間隔的短重復(fù)序列的區(qū)域。通過(guò)對(duì)菌株jx-6的分析發(fā)現(xiàn)其基因組上共存在5個(gè)CRISPR位點(diǎn)，并且CRISPR5在其序列上游區(qū)域存在著相關(guān)的cas基因，因此推測(cè)其在不同菌株中具有潛在的活性。基于上述推測(cè)分別對(duì)來(lái)自廣東、廣西、江西三地的不同菌株中的CRISPR5進(jìn)行PCR、克隆測(cè)序分析，其結(jié)果表明CRISPR5位點(diǎn)的重復(fù)單元具有可變性，與推測(cè)是相一致的，進(jìn)一步說(shuō)明了CRISPR5潛在的活性。
　　4、柑橘潰瘍