諾氟沙星免疫分析化學研究.pdf

1、本文以諾氟沙星為研究對象，并合成了諾氟沙星的半抗原 (NFLX-Hp)，經過提純后用紅外吸收光譜，質譜和核磁共振圖譜來測定半抗原的結構。采用活性酯法將半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共價偶聯，制備人工抗原和包被原，經紫外掃描確定偶聯情況并計算半抗原與載體蛋白的結合比。以NFLX-Hp-BSA為免疫原免疫新西蘭白兔，制備針對半抗原的特異性抗血清。間接ELISA法測定抗血清的中點效價達6.41×10<'4>，雙向瓊

2、脂擴散法測定抗血清的效價達1/64。兔頸動脈放血得抗血清，以硫酸銨分步鹽析法分離純化抗血清中的抗體并凍干，-20℃保存。采用活性酯法制備酶標半抗原(NFLX-Hp-HRP)，透析去除游離半抗原等小分子，再經Sephadex柱純化；酶標半抗原既保持了免疫化學活性，又保持了酶活性，可用于免疫化學分析。 進一步研究了pH值、離子強度和有機溶劑(甲醇、乙腈、丙酮)對包被抗體－酶標半抗原(E-H)直接競爭ELISA法的影響。結果表明：當包

3、被介質的pH值為6.2時，固相載體對抗體的吸附性最好；當反應介質的pH值同樣為6.2時，抗體與諾氟沙星的親和作用最強。離子強度在一定范圍內增大會提高抗體與諾氟沙星的親和力；甲醇、乙腈和丙酮含量大于5％影響諾氟沙星的免疫分析結果。 成功建立了諾氟沙星直接競爭酶聯免疫吸附分析法，方陣試驗確定了抗體的最佳包被濃度為10μg/mL，酶標半抗原最佳稀釋度為16000倍。在優(yōu)化條件下，建立了諾氟沙星的標準抑制曲線，回歸方程I=16.17Lo

4、gC+67.57，r<'2>=0.978，線性范圍為100～0.01μg/mL，抑制中濃度(IC<,50>)為0.082μg/mL，IC<,20>為1.14ng/mL，相對標準偏差(RSD)=8.33(n=5)。 抗體的特異性考察結果表明，半抗原的交叉反應率最大為38139.535，左氧氟沙星(Levofloxacin)、環(huán)丙沙星 (Ciprofloxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)的交叉反應率分別為8.884、

5、3.306和0.869。 在空白雞血清中分別添加諾氟沙星標樣，使樣品中諾氟沙星的含量分別為0.5mg/kg和5mg/kg兩個水平。添加樣品用1.0mol/mL的鹽酸提取，E-H直接競爭EIdSA法測定，重復4次。諾氟沙星添加濃度為0.5 mg/kg時，回收率86.34％～107.40％，平均值為97．285％，回收率的相對標準偏差(RSD)為8．86；諾氟沙星添加濃度為5 mg/kg時，回收率81.11％～101.91％，平均值