野桑蠶不同組織細胞色素P450 CYP305B1V1基因的誘導表達特征研究及其啟動子活性分析.pdf

1、細胞色素P450酶系是一類普遍存在于脊椎動物或無脊椎動物(包括昆蟲)、植物和微生物中的代謝酶系。在生命過程中，內源物質的代謝與轉化或外源化合物的活化與降解等都需要細胞色素P450酶系的催化與調控。野桑蠶(Bombyxmandarina Moore)是一種主要的鱗翅目害蟲，嚴重影響桑樹生長和蠶業(yè)發(fā)展，同時，它與家蠶有非常近的親緣關系。為深入了解野桑蠶細胞色素P450的結構和功能，我們就野桑蠶不同組織細胞色素P450 CYP305B1V1基

2、因的誘導表達特征及其啟動子活性開展了研究，主要研究結果如下： 用不同濃度梯度的NaF、蕓香苷、氯氰菊酯溶液浸泡過的桑葉添食家蠶和野桑蠶，研究不同藥物對野桑蠶和家蠶主要生理特征的影響。48 h后，各個試驗組中，家蠶和野桑蠶的死亡率分別為：10-4 mol/L NaF(66.7％，13.3％)；5×10-3ng/μL蕓香苷(60％，26.7％)；0.1 ng/μL氯氰菊酯(46.7％，11.3％)。家蠶的死亡率明顯高于野桑蠶，表明在

3、供試濃度范圍內，野桑蠶對NaF、蕓香苷和氯氰菊酯的耐受性明顯強于家蠶。 以上述四種藥物添食后存活的野桑蠶為材料，參照GenBank中公布的野桑蠶CYP305B1V1基因的mRNA序列，設計1對引物，采用半定量RT-PCR方法分析經NaF、蕓香苷、氯氰菊酯和蛻皮激素處理的野桑蠶各組織中CYP30581V1基因的表達情況，并對該基因的氨基酸序列進行同源比較和進化分析。結果顯示，氯氰菊酯、蕓香苷和NaF對于野桑蠶CYP305B1V1基

4、因在組織中的表達是有影響的，而蛻皮激素無明顯影響。氨基酸的同源性分析表明該基因氨基酸序列與家蠶CYP305B1的氨基酸序列同源性最高，為100％；與赤擬谷盜可能的CYP305 A1、蜜蜂可能的CYP305A1、果蠅CYP305A1、岡比亞按蚊CYP305A2及庫蚊CYP2L1之間有較高的同源性。 用PCR方法從野桑蠶基因組DNA中擴增了細胞色素P450 CYP305B1V1基因轉錄起始位點上游1000和1500 bp左右的2段序

5、列，構建由其驅動的螢火蟲熒光素酶基因報告質粒pGL-YTA和pGL-YTB，和內參載體pRL-TK一同在脂質體的介導下轉染Sf9細胞，通過用NaF、蕓香苷、蛻皮激素以及氯氰菊酯的誘導，體外分析該基因啟動子的轉錄活性及與調控相關的因素。結果發(fā)現(xiàn)pGL-YTA和pGL-YTB兩個報告質粒的熒光素酶相對活性分別是基本載體pGL3-Basic載體的5.2倍和2.1倍，說明這兩段序列都具有啟動子活性，且在轉錄起始位點上游1000-1500bp之間

6、的序列可能具有與轉錄抑制相關的元件。四種誘導物誘導結果表明，對于pGL-YTA，10-2mol/L的NaF可以使該啟動子在誘導前后相對活性增加1.8倍；對于pGL-YTB，10-2mol/L的NaF和0.05ng/μl的氯氰菊酯分別可以時該啟動子在誘導前后相對活性增加2.25倍和5.39倍。 基因誘導表達和啟動子活性分析綜合表明，CYP305B1V1基因在野桑蠶體內可能主要參與外源性的有毒物質的代謝過程，其具體作用機制還待進一步