農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜蛋白Brazzein基因轉(zhuǎn)化‘章姬’草莓的研究.pdf

1、草莓(Fragaria×ananassa Duch.)屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，是世界上廣泛栽培的重要經(jīng)濟(jì)果樹(shù)。隨著人們生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對(duì)草莓果實(shí)品質(zhì)的要求逐漸提高?，F(xiàn)代基因工程直接在基因水平上進(jìn)行改良，打破了物種間的界限，在培育抗病、抗蟲(chóng)、抗逆境和抗除草劑等草莓優(yōu)良品種中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。自開(kāi)展草莓轉(zhuǎn)基因研究以來(lái)，在草莓導(dǎo)入了多種有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的外源目的基因。植物甜蛋白Brazzein已經(jīng)在多種高等植物中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，但是表

2、達(dá)效果不盡相同，本實(shí)驗(yàn)的目的就是在前人研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)甜味蛋白Brazzein基因序列及其表達(dá)特性，通過(guò)重疊延伸PCR方法克隆了該基因全長(zhǎng)并構(gòu)建植物雙元表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入草莓中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.根據(jù)Brazzein基因的53氨基酸序列和雙子葉植物對(duì)遺傳密碼子的偏愛(ài)性設(shè)計(jì)引物，利用重疊PCR法合成了Brazzein基因全長(zhǎng)并在Brazzein全長(zhǎng)基因的5'端添加黃花梨防御素基因PpyDF

3、N1信號(hào)肽，（GenBank登錄號(hào)為HM044853），對(duì)該基因進(jìn)行了修飾，同時(shí)構(gòu)建了植物雙元表達(dá)載體PYH4215-Bra。該載體含有GUS報(bào)告基因和潮霉素Hyg抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（htp），T-DNA區(qū)三個(gè)外源基因均由CaMV35S啟動(dòng)子控制。該載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105用于‘章姬’草莓遺傳轉(zhuǎn)化。
　　 2.以‘章姬’草莓試管苗葉片為外植體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)草莓的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了研究。研究了菌液濃度、菌液侵染

4、時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、乙酰丁香酮濃度、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、潮霉素濃度、羧芐青霉素等因素對(duì)草莓遺傳轉(zhuǎn)化的影響，建立了高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果顯示，菌液濃度OD600=0.4-0.5，根據(jù)菌液濃度的大小適當(dāng)調(diào)節(jié)侵染時(shí)間，侵染時(shí)間6-8 min較適宜。共培養(yǎng)時(shí)間3d后直接轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，篩選暗14d后轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)效果較好，適宜的潮霉素濃度為4 mg/L，羧芐青霉素濃度為200mg/L。活化農(nóng)桿菌菌體時(shí)不需添加乙酰丁香酮。
　　 3.利用GUS

5、組織化學(xué)染色對(duì)124株抗性芽進(jìn)行了檢測(cè)，有58株抗性芽表現(xiàn)為GUS陽(yáng)性，陽(yáng)性率為46.8％;利用PCR和RT-PCR法對(duì)‘章姬’草莓的13株GUS陽(yáng)性株進(jìn)行了檢測(cè)，獲得了8株草莓轉(zhuǎn)基因植株，編號(hào)分別為Bra-1-Bra-8。
　　 4.以4個(gè)‘章姬’草莓轉(zhuǎn)基因株系為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)果實(shí)品比、可溶性固性物含量和可溶性糖含量的測(cè)定結(jié)果表明:4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，Bra-3株系果實(shí)明顯比其他株系果實(shí)甜度高，可溶性固形物含量達(dá)到21.33，顯著