新型甘藍型油菜核不育系的選育及隱性上位基因Bn;Rf的定位.pdf

1、油菜是我國主要的油料作物，其中甘藍型油菜種植最為廣泛。與其它類型的油菜相比，甘藍型油菜馴化時間較短、種質(zhì)資源較為狹窄，因而限制了其雜種優(yōu)勢潛力的發(fā)掘。為了充分發(fā)揮雜交種的優(yōu)勢，必須拓寬甘藍型油菜親本間的遺傳差異。7-750（ArArCnCn）是一種新型的甘藍型油菜，具有部分白菜型油菜的遺傳背景。將這種新油菜與普通的甘藍型油菜配組，將為甘藍型油菜強優(yōu)勢組合的選擇提供一條可能的途徑。
　　 利用雜種優(yōu)勢時，在具有強優(yōu)勢組合的基礎(chǔ)上，

2、還需要有一個經(jīng)濟有效的授粉控制系統(tǒng)，以保證雜交種子質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本。7-7365AB是隱性細胞核雄性不育純合兩型系，其不育性徹底、穩(wěn)定，恢復(fù)源廣泛，而且可以通過臨保系7.7365C的使用模擬質(zhì)不育，實現(xiàn)三系化制種。因此在本研究中，我們嘗試將隱性核不育系7-7365A中的核不育基因?qū)氲叫滦透仕{型油菜7-750（ArArCnCn）中，培育新型甘藍型油菜核不育系7-750A。并且將這種新不育系與普通的甘藍型油菜配制組合，以選育出優(yōu)良的雜交

3、組合。
　　 7-7365AB的可育性受到2對隱性不育基因（Bn；ms3和Bn；ms4）和一對隱性上位基因（Bn；rJ）控制。由于涉及到3對基因，通過傳統(tǒng)方法對不育系以及臨保系的選擇都較為困難。尤其對于臨保系的選擇，由于沒有對應(yīng)的表型，只能通過廣泛測交鑒定，使得選育工作更加困難。因此鑒定與．Bn；ms3、Bn；ms4和．Bn；rf連鎖的分子標(biāo)記將為不育系、尤其是臨保系的選育提供有效的手段。
　　 本研究以具有亞基因組雜種

4、優(yōu)勢的材料7-750、隱性細胞核雄性不育兩型系7-7365AB及其臨保系7-7365C作為基礎(chǔ)材料，對隱性上位基因Bn；Rf進行遺傳定位，同時采用分子標(biāo)記輔助選擇與回交育種相結(jié)合，選育具有亞基因組雜種優(yōu)勢的新型甘藍型油菜核不育系。研究結(jié)果如下：
　　 1．用甘藍型油菜純合兩型系7-7365AB中的不育單株與7-7365C雜交再與7-7365C回交構(gòu)建BC1分離群體。育性調(diào)查結(jié)果顯示，可育單株與不育單株滿足1：1的分離比。該BC1

5、分離群體用于Bn；Rf基因的定位。
　　 2．在回交分離群體（7-7365A×7-7365C）×7-7365C中，構(gòu)建了2對基因池（BF1和BS1：BF2和BS2），運用BSA法與AFLP分析相結(jié)合，共篩選768對AFLP引物組合（預(yù)擴增引物組合為PO/MC、PO/MG和EA/MC），獲得9個與目標(biāo)基因Bn；Rf緊密連鎖的標(biāo)記，命名為XM1-XM9。用這9個標(biāo)記去分析包含351個單株的BC1分離群體，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記XM5與目標(biāo)基因共分

6、離，XM2位于基因一側(cè)，其余7個標(biāo)記均位于基因另一側(cè)。標(biāo)記XM3和XM2分別為兩側(cè)最近標(biāo)記，與Bn；Rf之間的遺傳距離分別為0.6 cM和2.6 cM。
　　 3．利用連鎖分析中獲得的交換單株，構(gòu)建2對基因池（BF3和BS3；BF4和BS4）篩選更多與目標(biāo)基因連鎖更為緊密的標(biāo)記。共篩選768對引物組合（預(yù)擴增引物組合為EA/MG、SA/MC和SA/MG），獲得4個與目標(biāo)基因緊密連鎖的標(biāo)記，命名為XM10-XM13。通過分析發(fā)現(xiàn)，

7、這4個標(biāo)記與目標(biāo)基因共分離。
　　 4．在本研究之前，發(fā)現(xiàn)了3個與Bn；Rf基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記（涂金星，未發(fā)表），其中的一個標(biāo)記F09/10在本研究的BC1群體中，仍表現(xiàn)為與目標(biāo)基因緊密連鎖，通過連鎖分析發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記與XM2位于同側(cè)，與Bn；Rf基因間的遺傳距離為3.2cM。
　　 5．將獲得的13個AFLP標(biāo)記，1個SSR標(biāo)記分別回收、克隆，其中有7個AFLP片段（XM2、XM9、XM6、XM5、XM4、XM10、

8、XM13）和1個SSR片段（F09/F10）成功被克隆、測序。兩個片段XM5和XM13被成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，分別命名為XSC5和XSC13。
　　 6．為了獲得更多的序列信息，通過PCR-walking的方法成功分離了5個片段（XM2、XM9、XM6、XM4、F09/10）的側(cè)翼序列，將其分別延伸至1399bp、1903bp、951 bp、2092 bp和888 bp。用BLASTN分析檢測Bn；Rf位點與擬南芥之間的同源性

9、，共有4個標(biāo)記與擬南芥基因組的2個區(qū)域有同源性。這2個區(qū)域分別為擬南芥第1染色體上2.0Mb的一段區(qū)域以及第3染色體上一段4.2Mb的區(qū)域。
　　 7．利用DH群體（Tapidor×Ningyou7）對Bn；Rf基因進行遺傳定位。與Bn；Rf基因連鎖的標(biāo)記XM1被定位于N7連鎖群STS標(biāo)記IGF2021z和RFLP標(biāo)記px116a之間。從參考圖譜的N7連鎖群上挑選SSR標(biāo)記分析本研究的基因池及BC1群體，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記BRMS018（

10、Chen et al，2007）和CB10594（Piquemal et al，2005）與Bn；Rf基因連鎖，遺傳距離分別為14.3cM和27.4cM，進一步證實了Bn；Rf基因的位置。
　　 8．通過分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）與傳統(tǒng)表型選擇及品質(zhì)分析相結(jié)合，應(yīng)用回交轉(zhuǎn)育的方法，將隱性核不育系7-7365A的不育基因?qū)氲叫滦透仕{型油菜7-750中。在前兩輪的輔助選擇中，在花期對分離群體中的不育單株進行背景分析，選擇3個單株與

11、7-750回交，收獲后，通過品質(zhì)分析、同時結(jié)合田間表現(xiàn)選擇一個株系進入下一輪的輔助選擇。
　　 9．在第3輪的輔助選擇中，利用本研究室發(fā)展的與不育基因（Bn；ms3和Bn；ms4）連鎖的標(biāo)記，在苗期對群體中的單株進行前景選擇，分別選擇不育單株（Bn；ms3ms3ms4ms4RfRf）和保持單株（Bn；Ms3ms3ms4 ms4RfRf），然后對中選單株進行背景分析，在花期結(jié)合田間表現(xiàn)選擇候選A、B單株進行兄妹交。
　　

12、10．在兄妹交一代的分離群體中，選擇田間表現(xiàn)較好的不育單株與9個恢復(fù)系配制雜交組合，同時用改良前的不育系也與9個恢復(fù)系配制組合。18個雜交組合、親本及對照于2007年秋播種，隨機區(qū)組設(shè)計設(shè)置3次重復(fù)。第二年五月考種，共考察10個產(chǎn)量相關(guān)性狀。結(jié)果表明，8個改后組合的產(chǎn)量超過了相應(yīng)的改前組合，其中有3個組合（7-7365-1×7-107、7-7365-1×7-138和7-7365-1×7-1260）的產(chǎn)量超過對照中油雜2號10％以上，超標(biāo)

13、優(yōu)勢率分別為18.18％，12.78％和12.78％。
　　 11．配合力分析表明，改良后的新型甘藍型油菜核不育系的一般配合力效應(yīng)值，除分枝部位和千粒重表現(xiàn)為負(fù)值之外，其余的8個性狀均為正效應(yīng)，且株高、一次分枝、主花序長度、主花序角果數(shù)、全株角果數(shù)和單株產(chǎn)量顯著高于改良前的不育系（7-7365A），說明了白菜型油菜基因組中的確存在提高甘藍型油菜產(chǎn)量潛力的遺傳成分。
　　 12．通過相關(guān)分析得知，遺傳距離與F1多數(shù)性狀的一