牛結(jié)核分枝桿菌溶血磷脂酶蛋白的表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備.pdf

1、牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)是引起牛結(jié)核病的病原體，侵染宿主廣泛，可感染多種家畜和野生動(dòng)物，對(duì)人類和動(dòng)物健康構(gòu)成巨大危害。溶血磷脂酶是催化溶血磷脂失活的主要途徑，被認(rèn)為在調(diào)節(jié)生物活性脂質(zhì)水平中起關(guān)鍵作用。但牛結(jié)核分枝桿菌溶血磷脂酶(LLP)的功能及作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用基因重組技術(shù)，克隆了LIP基因，成功構(gòu)建其表達(dá)載體pET30a(+)-LIP，誘導(dǎo)其高效表達(dá)、純化蛋白并制備多克隆抗體，為進(jìn)一步研究牛結(jié)核分

2、枝桿菌溶血磷脂酶(LIP)的功能及在牛結(jié)核分枝桿菌中的作用奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.以牛結(jié)核分枝桿菌的DNA為模板，通過PCR的方法擴(kuò)增克隆LIP基因，并進(jìn)行了核苷酸序列測(cè)定。結(jié)果表明，核苷酸序列與GenBank上所公布的序列同源性為100％。
　　 2.將所擴(kuò)增基因克隆于原核表達(dá)載體pET30a(+)，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western blo

3、t分析，結(jié)果證明LIP蛋白獲得高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總量的31％，分子量大小為30kD左右；利用割膠回收法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，純化率大于95％。
　　 3.重組LIP蛋白能夠與患牛結(jié)核病的牛陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，有望成為牛結(jié)核分枝桿菌新的診斷抗原，為進(jìn)一步研究牛結(jié)核分枝桿菌溶血磷脂酶的功能及在牛結(jié)核分枝桿菌中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.成功地制備了針對(duì)LIP蛋白的特異性多克降抗體，通過間接ELISA檢測(cè)，該多克隆抗體