芐嘧磺隆降解菌的分離鑒定特性研究及生態(tài)學(xué)研究.pdf

1、本論文主要以浙江大學(xué)華家池校區(qū)農(nóng)場(chǎng)淹水稻田土壤為研究材料,以我國(guó)水稻田中廣泛使用的磺酰脲類(lèi)除草劑芐嘧磺隆為主要研究對(duì)象,篩選分離到幾株芐嘧磺隆降解菌株,并對(duì)降解菌株的生長(zhǎng)及降解特性進(jìn)行了初步探討;綜合運(yùn)用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法及現(xiàn)代分子生物學(xué)手段,采用室內(nèi)培養(yǎng)、純培養(yǎng)及統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合的方法,全面探討了磺酰脲類(lèi)除草劑芐嘧磺隆對(duì)淹水稻田土壤可培養(yǎng)微生物種群數(shù)量、土壤酶活性、土壤呼吸以及微生物生態(tài)的毒性效應(yīng),為建立有效的除草劑污染預(yù)警指標(biāo)體系、環(huán)境質(zhì)量

2、評(píng)價(jià)及芐嘧磺隆降解菌株的有效利用提供了有益參考。本研究主要結(jié)果如下： 1、從供試土樣中共分離純化得到4株芐嘧磺隆降解效率較高的菌株,將其中1株降解效率最高的芐嘧磺隆降解菌株編號(hào)為D5。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化分析、G+C mol％、16S rDNA序列同源性比較和Biolog碳源利用分析,初步鑒定該菌株為巨大芽孢桿菌菌株(Bacillus　megaterium)。其它3株芐嘧磺隆降解菌株A2、B2和D2分別與三氯乙烯降解菌株Rhod

3、ococcus sp.L4、類(lèi)短短芽孢桿菌Brevibacillus parabrevis IFO 12334T和苯胺降解菌株Rhodococcus sp.AN-22的相似度最高,分別達(dá)到99.7％、100％和100％。 菌株D5能較好利用芐嘧磺隆、綠磺隆、氯嘧磺隆和嘧磺隆等四種磺酰脲類(lèi)除草劑；能很好利用苯、葸酮、三唑磷、敵敵畏和樂(lè)果；可以利用二甲苯、硝基苯、對(duì)苯二胺、間苯二酚、鄰苯二酚、苯酚、敵百蟲(chóng)、毒死蜱和喹硫磷：不能利用萘

4、、甲苯和十溴聯(lián)苯醚?？梢?jiàn),D5既可以利用磺酰脲類(lèi)除草劑,又可以利用有機(jī)磷農(nóng)藥和部分芳香族化合物。可為多功能菌(菌群)的研究提供良好材料,有一定的研究?jī)r(jià)值。抗敏性結(jié)果表明,菌株D5對(duì)設(shè)定濃度范圍內(nèi)的所有供試抗生素都很敏感,對(duì)青霉素鈉、氨芐青霉素、先鋒霉素V和VI尤為敏感,均產(chǎn)生較大的抑菌圈。 芐嘧磺隆降解菌株D5在pH 6.5-9的范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng),以在pH 7.5時(shí)生長(zhǎng)最佳；菌株D5在10-40℃的溫度范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng),30℃是

5、最佳生長(zhǎng)溫度；芐嘧磺隆濃度對(duì)菌株D5的生長(zhǎng)有一定的影響,50 mg L-1時(shí)菌株D5生長(zhǎng)最好；裝液量為25-150 ml(250 ml三角瓶),菌株D5均可以生長(zhǎng),通氣量為1/5體積時(shí)菌株生長(zhǎng)狀況最好；M2+濃度為100-500 mg L-1的范圍內(nèi),菌株均可以生長(zhǎng),以Mg2+濃度為400 mg L-1時(shí)菌株D5的生長(zhǎng)最佳。分別以酵母膏為唯一碳源和以葡萄糖為唯一氮源時(shí),菌株D5生長(zhǎng)最好。 菌株D5純培養(yǎng)和四株降解菌株混培對(duì)整體生

6、物量的影響不同。pH 7.5和30℃時(shí),芐嘧磺隆降解效果最好。液體培養(yǎng)基中84 h芐嘧磺隆的降解達(dá)到97.7％。說(shuō)明菌株D5具有較好的降解能力。對(duì)添加降解菌株D5以及D5和BH混合菌劑后的芐嘧磺隆降解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：整個(gè)取樣過(guò)程中,不同濃度的芐嘧磺隆均有一定程度的降解,降解情況取決于施用的芐嘧磺隆濃度。降解菌劑的加入對(duì)芐嘧磺隆在淹水稻田土壤中的降解有一定的促進(jìn)作用,以只加降解菌株D5菌劑的降解效果為佳。模擬田間淹水稻田土壤中42 d

7、時(shí),芐嘧磺隆的降解達(dá)到94.3％,其中微生物降解達(dá)到32.5％,而試驗(yàn)過(guò)程中降解菌株細(xì)胞數(shù)量基本保持穩(wěn)定,未發(fā)現(xiàn)其它污染微生物的存在,說(shuō)明菌株D5在整個(gè)降解過(guò)程中起到積極作用。進(jìn)一步證明了淹水稻田土樣中利用微生物對(duì)芐嘧磺隆污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)的可能性。混合菌劑對(duì)四種除草劑均有較好的降解效果。 芐嘧磺隆誘導(dǎo)后的菌株全細(xì)胞蛋白電泳顯示出特異性條帶,說(shuō)明該條帶可能是與芐嘧磺隆的降解或解毒有關(guān)的蛋白。紫外誘變方法篩選到降解特性可以穩(wěn)定遺

8、傳的突變體6。 2、采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究不同濃度芐嘧磺隆的施用對(duì)淹水稻田土壤可培養(yǎng)微生物(好氧細(xì)菌、真菌、放線菌、固氮細(xì)菌、氨化細(xì)菌、纖維素分解菌、硫化細(xì)菌以及厭氧固氮細(xì)菌和反硫化細(xì)菌)種群數(shù)量、土壤呼吸和土壤酶(過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶和多酚氧化酶)活性的影響。結(jié)果表明：恒溫培養(yǎng)條件下,不同濃度芐嘧磺隆的施用對(duì)淹水稻田土壤微生物種群數(shù)量、土壤呼吸強(qiáng)度和土壤酶活性有不同影響。 芐嘧磺隆的施用能夠影響淹水稻田土壤可培養(yǎng)微生

9、物的生長(zhǎng),影響程度取決于芐嘧磺隆的施用劑量。低濃度芐嘧磺隆顯著刺激纖維素分解菌和硫化細(xì)菌的生長(zhǎng)(P<0.05;P<0.05)。14 d時(shí),0.067和0.335 μg g-1干土的芐嘧磺隆處理土樣中的放線菌數(shù)量顯著高于對(duì)照水平；7 d和14 d時(shí),0.067和0.335μg g-1干土的芐嘧磺隆處理土樣中氨化細(xì)菌數(shù)量顯著高于對(duì)照水平；21d和28 d下降到低于對(duì)照水平。高劑量(3.553μg g-1干土)的芐嘧磺隆對(duì)好氧異養(yǎng)細(xì)菌(AHB

10、)、放線菌、好氧固氮菌、氨化細(xì)菌和纖維素分解菌的生長(zhǎng)均有強(qiáng)烈的抑制作用。盡管芐嘧磺隆在培養(yǎng)初期對(duì)處理土樣中的可培養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)有一定的影響作用,但是,除AHB和好氧纖維素分解菌外,這種影響都不是持久性的。因此,低劑量芐嘧磺隆對(duì)土壤可培養(yǎng)微生物種群安全,而高劑量的芐嘧磺隆對(duì)土壤可培養(yǎng)微生物種群數(shù)量有一定的消極影響。 芐嘧磺隆施用初期能刺激土壤呼吸強(qiáng)度,隨后產(chǎn)生輕微的抑制作用,這種抑制作用在取樣后期逐漸減輕并趨于對(duì)照水平。芐嘧磺隆能

11、輕微刺激過(guò)氧化氫酶活性,而蔗糖酶活性基本不受芐嘧磺隆施用量的影響,脲酶活性則是先刺激后抑制,多酚氧化酶活性受芐嘧磺隆影響不大。說(shuō)明施用一定量的芐嘧磺隆對(duì)淹水稻田土壤生態(tài)環(huán)境是安全的。 3、在傳統(tǒng)微生物污染生態(tài)研究基礎(chǔ)上,運(yùn)用現(xiàn)代分子生態(tài)學(xué)手段,獲得可用于高效擴(kuò)增16S rDNA的V3可變區(qū)的直接提取的高質(zhì)量土壤總DNA,并采用DGGE分子指紋技術(shù),對(duì)芐嘧磺隆污染條件下淹水稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了初步探討。通過(guò)DGGE圖譜

12、分析發(fā)現(xiàn),芐嘧磺隆的施用對(duì)淹水稻田土壤微生物種群結(jié)構(gòu)有一定的影響,處理第4周,這種影響有所減弱,對(duì)照土樣和芐嘧磺隆處理土樣中微生物群落多樣性差異較??；處理第5周,對(duì)照土樣和芐嘧磺隆處理土樣中微生物群落多樣性差異進(jìn)一步減小,幾乎相同。從處理1-5周土樣的DGGE圖譜中還可以發(fā)現(xiàn),低濃度芐嘧磺隆處理土樣中微生物群落結(jié)構(gòu)之間差異較小,可近似認(rèn)為低濃度芐嘧磺隆對(duì)淹水稻田土壤微生物是安全的,這與前面兩章對(duì)土壤可培養(yǎng)微生物和土壤酶活性以及土壤呼吸的

13、研究所得出的結(jié)論一致。芐嘧磺隆是一種相對(duì)比較安全的除草劑,可以大力推廣在田間使用。芐嘧磺隆降解菌D5菌劑的添加能夠緩解芐嘧磺隆的負(fù)面效應(yīng),刺激其它細(xì)菌的生長(zhǎng),使土樣微生物基因多樣性提高。處理土樣中,不同取樣時(shí)間微生物群落結(jié)構(gòu)之間存在著顯著的差異：不同取樣時(shí)間DGGE電泳條帶有增有減,特征條帶(敏感微生物)亮度很強(qiáng)。本研究是一個(gè)新的嘗試,即添加芐嘧磺隆降解菌株來(lái)修復(fù)芐嘧磺隆污染的土壤。 4、以大腸桿菌(Escherichia co

14、li)K12、枯草芽孢桿菌(Bacillus subfilis)B19等土壤典型微生物及芐嘧磺隆降解菌(Bacillus megaterium)D5為試驗(yàn)材料,通過(guò)對(duì)土壤典型微生物和芐嘧磺隆降解菌株的生長(zhǎng)、活性、應(yīng)激反應(yīng)以及生化指標(biāo)方面的影響研究,初步探討了芐嘧磺隆脅迫對(duì)微生物純培養(yǎng)的生理毒性。結(jié)果如下：加入不同濃度芐嘧磺隆的培養(yǎng)基中,兩種G+細(xì)菌和一種G-細(xì)菌均表現(xiàn)出SOD、CAT和ATPase的活性。說(shuō)明芐嘧磺隆對(duì)三種供試細(xì)菌均有一

15、定程度的誘導(dǎo)作用。但對(duì)芐嘧磺隆降解菌株D5的誘導(dǎo)作用弱于其他2種非芐嘧磺隆降解菌株,這可能與降解菌株D5能降解芐嘧磺隆有關(guān)。SOD和CAT活性的增加是機(jī)體對(duì)抗氧化脅迫的一種適應(yīng)性變化,而ATPase在細(xì)菌抗氧化脅迫過(guò)程中也發(fā)生一系列變化,從而使得將微生物體內(nèi)SOD、CAT和ATPase活性作為環(huán)境受到污染脅迫的分子指標(biāo)具有一定可行性。活性染色條帶的變化可能是由于菌株SOD的表達(dá)量不同或芐嘧磺隆對(duì)SOD的組成產(chǎn)生了某種影響。有關(guān)結(jié)論需要進(jìn)