從噬菌體抗體庫中淘選B淋巴細胞刺激因子(BlyS)的中和抗體.pdf

1、　　BlyS(B lymphocyte Stimulator)是TNF超家族的一個成員,它在體內(nèi)的過量表達與B細胞介導的自身免疫病有關,本實驗旨在從BIyS免疫的小鼠的脾臟建立單鏈抗體(scFv即single chain variable fragment)庫,從中篩選能抑制BlyS與其受體BCMA的結合的中和抗體。
　　從用BlyS免疫的小鼠的脾臟抽提RNA,然后反轉(zhuǎn)錄cDNA,再以此為范本PCR擴增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū),通過o

2、ver-lap PCR得到scFv基因。將scFv用限制性內(nèi)切酶sfiI酶切后克隆到同樣用sfiI酶切的噬菌粒上(這樣scFv就和噬菌粒上的M13噬菌體的基因Ⅲ蛋白融合,可以將scFv表達于噬菌體表面),將此噬菌粒電轉(zhuǎn)到大腸桿菌XL1-Blue中,建立了免疫型的鼠源的噬菌體展示BlyS單鏈抗體(scFv)庫。
　　用5μg/mlBlyS包被免疫管,經(jīng)過五輪的Biopanning,與BlyS結合的抗體陽性率由第三輪的55%上升到第五

3、輪的100%；第三、四、五輪的各20個克隆中經(jīng)ELISA篩選得到的六個沒有交叉反應的克隆(3-5、4-1、4-5、4-12、4-16、4-19),通過測序可進一步證實BlyS抗體的富集：4-1、4-5、4-12、4-16、4-19的重鏈序列完全相同,而3-5的序列與它們完全不同。
　　將3-5和4-16的scFv基因克隆到表達載體pTc上,在表達菌BL21(DE3)進行表達得到可溶性scFv。用可溶性scFv進行競爭ELISA和其